南苜蓿叶黄酮提取及其抑菌作用分析【字数：8352】
摘 要本实验以南苜蓿叶黄酮提取率为指标，采用酶解法辅助乙醇提取南苜蓿叶总黄酮，采用单因素试验以及响应面法，分别考察复合酶比例、酶解时间、酶解温度以及复合酶用量对南苜蓿叶黄酮提取率的影响。试验单因素结果表明，酶解时间、温度和复合酶用量都对南苜蓿叶总黄酮提取率有显著影响，且最佳提取工艺条件为复合酶用量为 3.0% ，酶解时间为15.7 min，酶解温度39.0℃，在此工艺条件下，南苜蓿叶黄酮提取率达到 (1.9±0.3)% 。其后以金黄色葡萄球菌和大肠杆菌作为指示菌，通过测试南苜蓿叶黄酮化合物对其的最低抑菌活性MIC，得出其对大肠杆菌的MIC为0.15mg/mL，对金黄色葡萄球菌的MIC为0.2 mg/mL。该课题为大规模提取南苜蓿黄酮提供理论基础，并对南苜蓿黄酮的抑菌效果进行有效论证，对南苜蓿黄酮开发利用保健产品建立了科学依据。
目 录
1. 前言1
2. 材料与方法2
2.1 实验准备2
2.1.1 原料与试剂2
2.1.2 仪器与设备2
2.2 南苜蓿叶黄酮提取方法2
2.2.1 南苜蓿的预处理2
2.2.2 酶解辅助乙醇提取南苜蓿叶黄酮2
2.2.3 芦丁标准曲线绘制3
2.2.4 总黄酮提取率的测定3
2.2.5 提取工艺优化4
2.2.6 抑菌实验5
3.结果与讨论6
3.1单因素实验结果6
3.1.1纤维素酶与果胶酶的比例对黄酮提取率的影响6
3.1.2 复合酶解温度对黄酮提取率的影响6
3.1.3 复合酶解时间对黄酮提取率的影响7
3.1.4 复合酶用量对黄酮提取率的影响7
3.2 响应面实验8
3.2.1 方案设计与结果8
3.2.2 回归方程与方差分析9
3.2.3 响应面分析10
3.2.4最佳提取方案验证试验13
3.3 抑菌性结果分析13
4. 结论14
参考文献15
致谢16
1. 前言
由于抗生素等化学抑菌药物的滥用，病 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
原菌日渐强大的抗药性已经成为21世纪最为严峻的挑战之一。人们研究一种新的药物往往需要510年，而病菌产生抗药性或者更新换代只需要两三年即可。人们研究新药的速度已经远远不及病菌发展的速度。所以开发纯天然提取的比较温和的抗菌药物是当下生物界和医药界热议的话题。
南苜蓿，在不同的地方有不同的称呼，由于其对环境要求不高，所以其产量很大，而且生长快速。在不同的地方也就有了不同的别名，比如在常熟地区就叫草头，江浙地区一片还有叫金花菜、黄花苜蓿等。《名医别录》中记载：“苜蓿，安中利人，可久食。”南苜蓿作为一种中药，具有多种养生调理的作用，清热退火，对一些病症还有配合治疗的作用。而在现代医学里，从南苜蓿中提取出的活性物质，黄酮类化合物，能够有效的清除人体自由基，对人体来说，具有抗肿瘤，延缓人体衰老等多种对人体的保健作用。[ 1 ]
南苜蓿黄酮的含量会因为季节和品种的不同而不同。[ 23 ]一般来说，同一品种的南苜蓿，五月份的南苜蓿黄酮含量比十一月份的黄酮含量更高。[ 4 ]本实验选取了常熟地区被称为“草头”的一种野菜为研究对象，学名叫做“南苜蓿”。经过前期的研究与预实验，我发现南苜蓿的黄酮大多数都是存在于其茎叶内，而新鲜叶片中的南苜蓿黄酮含量又最多。[ 5 ]经过资料查询，南苜蓿叶黄酮提取选择了乙醇提取并辅助以酶解法进行方法优化，在酶比例、复合酶解时间、复合酶解温度、复合酶用量单因素试验的基础上，再进行响应面实验，以实现提高总黄酮提取率的目的。在提取出南苜蓿叶黄酮后，测试其对于试验菌的最低抑菌浓度，从而研究其抑菌效果，为南苜蓿黄酮生产医疗保健品提供理论基础。[ 6 ]
2. 材料与方法
2.1 实验准备
2.1.1 原料与试剂
南苜蓿（常熟本地10月产），芦丁标准品，亚硝酸钠，硝酸铝，氢氧化钠，果胶酶，纤维素酶，酒精。
2.1.2 仪器与设备
烘箱，中药粉碎机，20目筛网，精密天平，容量瓶(1000 mL，100 mL，50 mL），锥形瓶（250 mL），移液管（10 mL，5 mL，1 mL，0.5 mL），25 mL试管，25 mL比色管，抽滤装置，分光光度计,培养皿，水浴锅，高压蒸汽灭菌锅，超净工作台，pH计。
2.2 南苜蓿叶黄酮提取方法
2.2.1 南苜蓿的预处理
挑拣南苜蓿的新鲜绿色叶片，置于70℃ 恒温烘箱内干燥48小时，之后每隔半小时，将其中一份样品进行称量，直至称量的质量不发生变化。取出干叶片用中药粉碎机打成过20目筛网的细粉，用袋子密封装好放在通风干燥的地方避光保藏。
2.2.2 芦丁标准曲线绘制
将芦丁标准对照品置于120℃ 烘箱里烘至恒重（以此当作黄酮的标准比照品），在精密天平上称取干燥后的芦丁对照品 20.41 mg ，用适量 50％ 的酒精溶解后倒入 100 mL 容量瓶中，用 50％ 酒精溶液冲洗两次后并入容量瓶，继续加入50％ 的酒精溶液定容至刻度，配置成的溶液即为浓度为 0.2 mg/mL 的黄酮标准品母液，摇匀后密封避光常温保存备用。[ 7 ]
精确量取 25 mL 上述浓度为 0.2 mg/mL 的标准对照品母液置于 50 mL 容量瓶中，用 50％ 乙醇溶液定容至标准刻度线，配得浓度为 0.1 mg/mL 的芦丁标准对照品溶液，摇匀后留待使用。
分别精确吸取上述所配的 0.1 mg/mL 芦丁标准对照品溶液 1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL 于 25 mL 比色管中，分别加入 1.0mL 5%NaNO2溶液，充分混匀后静置 6 min; 再加入 1 mL 10% Al( NO3)3 溶液，充分混匀后静置 5 min，再加入10.0mL 4% NaOH 溶液，用 50％ 酒精溶液定容至标准刻度线，充分混匀后静置 15 min。为了使数据更加精确，每份样品都要制备 3 份平行样品，以 50％ 酒精溶液进行相同步骤作为空白对照，用分光光度计测定其在 510 nm 处测量每个样品的吸光度值A，记录数值。[ 8 ]以标准芦丁样品浓度为横坐标，加入 1.0 mL、2.0 mL、 3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL 的所配的 0.1 mg/mL 芦丁标准对照品溶液，其对应的黄酮浓度分别为0.004 mg/mL、0.008 mg/mL、0.012 mg/mL、0.016 mg/mL、0.02 mg/mL、0.024mg/mL，在510nm处测出的吸光度值为纵坐标，绘制出标准曲线，计算该标准曲线的回归方程及相关系数。其标准曲线的回归方程为y=12.595x0.0068。
目 录
1. 前言1
2. 材料与方法2
2.1 实验准备2
2.1.1 原料与试剂2
2.1.2 仪器与设备2
2.2 南苜蓿叶黄酮提取方法2
2.2.1 南苜蓿的预处理2
2.2.2 酶解辅助乙醇提取南苜蓿叶黄酮2
2.2.3 芦丁标准曲线绘制3
2.2.4 总黄酮提取率的测定3
2.2.5 提取工艺优化4
2.2.6 抑菌实验5
3.结果与讨论6
3.1单因素实验结果6
3.1.1纤维素酶与果胶酶的比例对黄酮提取率的影响6
3.1.2 复合酶解温度对黄酮提取率的影响6
3.1.3 复合酶解时间对黄酮提取率的影响7
3.1.4 复合酶用量对黄酮提取率的影响7
3.2 响应面实验8
3.2.1 方案设计与结果8
3.2.2 回归方程与方差分析9
3.2.3 响应面分析10
3.2.4最佳提取方案验证试验13
3.3 抑菌性结果分析13
4. 结论14
参考文献15
致谢16
1. 前言
由于抗生素等化学抑菌药物的滥用，病 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
原菌日渐强大的抗药性已经成为21世纪最为严峻的挑战之一。人们研究一种新的药物往往需要510年，而病菌产生抗药性或者更新换代只需要两三年即可。人们研究新药的速度已经远远不及病菌发展的速度。所以开发纯天然提取的比较温和的抗菌药物是当下生物界和医药界热议的话题。
南苜蓿，在不同的地方有不同的称呼，由于其对环境要求不高，所以其产量很大，而且生长快速。在不同的地方也就有了不同的别名，比如在常熟地区就叫草头，江浙地区一片还有叫金花菜、黄花苜蓿等。《名医别录》中记载：“苜蓿，安中利人，可久食。”南苜蓿作为一种中药，具有多种养生调理的作用，清热退火，对一些病症还有配合治疗的作用。而在现代医学里，从南苜蓿中提取出的活性物质，黄酮类化合物，能够有效的清除人体自由基，对人体来说，具有抗肿瘤，延缓人体衰老等多种对人体的保健作用。[ 1 ]
南苜蓿黄酮的含量会因为季节和品种的不同而不同。[ 23 ]一般来说，同一品种的南苜蓿，五月份的南苜蓿黄酮含量比十一月份的黄酮含量更高。[ 4 ]本实验选取了常熟地区被称为“草头”的一种野菜为研究对象，学名叫做“南苜蓿”。经过前期的研究与预实验，我发现南苜蓿的黄酮大多数都是存在于其茎叶内，而新鲜叶片中的南苜蓿黄酮含量又最多。[ 5 ]经过资料查询，南苜蓿叶黄酮提取选择了乙醇提取并辅助以酶解法进行方法优化，在酶比例、复合酶解时间、复合酶解温度、复合酶用量单因素试验的基础上，再进行响应面实验，以实现提高总黄酮提取率的目的。在提取出南苜蓿叶黄酮后，测试其对于试验菌的最低抑菌浓度，从而研究其抑菌效果，为南苜蓿黄酮生产医疗保健品提供理论基础。[ 6 ]
2. 材料与方法
2.1 实验准备
2.1.1 原料与试剂
南苜蓿（常熟本地10月产），芦丁标准品，亚硝酸钠，硝酸铝，氢氧化钠，果胶酶，纤维素酶，酒精。
2.1.2 仪器与设备
烘箱，中药粉碎机，20目筛网，精密天平，容量瓶(1000 mL，100 mL，50 mL），锥形瓶（250 mL），移液管（10 mL，5 mL，1 mL，0.5 mL），25 mL试管，25 mL比色管，抽滤装置，分光光度计,培养皿，水浴锅，高压蒸汽灭菌锅，超净工作台，pH计。
2.2 南苜蓿叶黄酮提取方法
2.2.1 南苜蓿的预处理
挑拣南苜蓿的新鲜绿色叶片，置于70℃ 恒温烘箱内干燥48小时，之后每隔半小时，将其中一份样品进行称量，直至称量的质量不发生变化。取出干叶片用中药粉碎机打成过20目筛网的细粉，用袋子密封装好放在通风干燥的地方避光保藏。
2.2.2 芦丁标准曲线绘制
将芦丁标准对照品置于120℃ 烘箱里烘至恒重（以此当作黄酮的标准比照品），在精密天平上称取干燥后的芦丁对照品 20.41 mg ，用适量 50％ 的酒精溶解后倒入 100 mL 容量瓶中，用 50％ 酒精溶液冲洗两次后并入容量瓶，继续加入50％ 的酒精溶液定容至刻度，配置成的溶液即为浓度为 0.2 mg/mL 的黄酮标准品母液，摇匀后密封避光常温保存备用。[ 7 ]
精确量取 25 mL 上述浓度为 0.2 mg/mL 的标准对照品母液置于 50 mL 容量瓶中，用 50％ 乙醇溶液定容至标准刻度线，配得浓度为 0.1 mg/mL 的芦丁标准对照品溶液，摇匀后留待使用。
分别精确吸取上述所配的 0.1 mg/mL 芦丁标准对照品溶液 1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL 于 25 mL 比色管中，分别加入 1.0mL 5%NaNO2溶液，充分混匀后静置 6 min; 再加入 1 mL 10% Al( NO3)3 溶液，充分混匀后静置 5 min，再加入10.0mL 4% NaOH 溶液，用 50％ 酒精溶液定容至标准刻度线，充分混匀后静置 15 min。为了使数据更加精确，每份样品都要制备 3 份平行样品，以 50％ 酒精溶液进行相同步骤作为空白对照，用分光光度计测定其在 510 nm 处测量每个样品的吸光度值A，记录数值。[ 8 ]以标准芦丁样品浓度为横坐标，加入 1.0 mL、2.0 mL、 3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL 的所配的 0.1 mg/mL 芦丁标准对照品溶液，其对应的黄酮浓度分别为0.004 mg/mL、0.008 mg/mL、0.012 mg/mL、0.016 mg/mL、0.02 mg/mL、0.024mg/mL，在510nm处测出的吸光度值为纵坐标，绘制出标准曲线，计算该标准曲线的回归方程及相关系数。其标准曲线的回归方程为y=12.595x0.0068。
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