桃果实成熟期间sod基因表达情况
摘要: SOD是抗氧化体系中的关键酶类，低温下果实成熟衰老过程中SOD所起到的调控作用对于进一步了解果实的成熟机理具有指导意义。本课题以“霞晖5号”桃果实为材料，研究了桃果实在低温储藏下生理生化水平的变化并采用生物信息学技术对SOD基因家族进行克隆分析，再应用Real-time RT-PCR等技术对“霞晖5号”桃果实在低温贮藏阶段SOD基因表达差异进行研究。实验表明低温能够有效延缓桃果实的能量代谢，降低乙烯和呼吸释放速率，长期的低温贮藏会造成细胞膜完整性的破坏和活性氧的积累，导致果实硬度降低，位于不同细胞器的SOD各家族成员在桃果实成熟衰老的不同时期对活性氧起着调控作用。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Keywords3
1.前言3
2 材料与方法4
2.1 材料4
2.1.1 实验药物与试剂4
2.1.2 实验仪器与设备4
2.2方法5
2.2.1 实验原料5
2.2.2呼吸活力及乙烯释放测定5
2.2.3超氧阴离子，过氧化氢的测定5
2.2.4 SOD酶活测定 6
2.2.5 RNA的提取及实时荧光定量PCR分析 6
2.2.6 数据分析6
3 结果分析6
3.1乙烯产量分析6
3.2 呼吸活力分析7
3.3 过氧化氢分析7
3.4 超氧阴离子分析7
3.5 桃果实中SOD家族8
4讨论9
致谢 10
参考文献 11
桃果实成熟期间SOD基因表达水平
引言
1.前言
果实的成熟衰老一直被看作是一个极其复杂的过程，对于呼吸跃变型的果实而言，其成熟衰老的过程中往往伴随着呼吸越变高峰及乙烯的大量生成。并在越变过后，随着果实的继续成熟，呼吸速率也呈现出稳定的下降趋势[1]。与此同时，果实的成熟衰老过程也可以看做一个氧化的现象，在这过程中通过一系列的转化从而产生氧自由基(ROS)，如单线态氧(1O2)，超氧阴离子(O2)，过氧化氢(H2O2)，羟基
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
氧(HO)等等。在近几年对植物生理的研究中已经证实ROS具有双重作用，一方面它是有氧代谢过程中所产生的毒害分子，而另一方面它也是植物生长，发育，成熟衰老以及防御途径中的一个关键调控因子。然而，当ROS 过量产生时，它则会通过氧化对维持细胞完整性起关键性作用的分子来直接对细胞的功能产生影响，从而引起细胞死亡。因此通过抗氧化系统来调节ROS的产生和清除使其保持在一个稳态水平上是至关重要的[17]。
SOD是由多个同源蛋白组成的抗氧化酶类，它们构成了抵御ROS的第一道防线，是最为重要的一类抗氧化酶，其能够催化O2发生歧化作用生成氧气和过氧化氢，在保护组织免受受ROS危害上扮演了重要作用[2]。SOD可根据其金属辅助因子和/或亚细胞分布情况进行分类，植物中SOD的主要形式包括线粒体MnSOD，细胞溶质Cu/ZnSOD，叶绿体Cu/ZnSOD以及铁FeSOD。此外，植物SOD还被定位于过氧化物酶体、乙醛酸循环体、液泡、核及细胞外基质等多个细胞器中。植物中SOD基因的表达受生长和环境因素的调节，包括激素、光强度、温度、UV和干旱等等。许多研究已经证实其在种子萌发、叶片衰老和抗胁迫方面均有极其重要的作用，而在果实成熟衰老的研究方面，Qin等对采后桃果实的线粒体蛋白的研究指出，随着果实衰老的进程，氧化胁迫会加重,引起MnSOD表达量及活性的紊乱,进而刺激了ROS的积累，不断升高的ROS可能使其他相关蛋白更容易羰基化，从而加速了果实的衰老[6]。Chan等人对经水杨酸（SA）采后处理过的桃果实进行蛋白质组学研究发现，GPX、CAT、SOD等6个抗氧化蛋白表达出现。了显著差异，表明了部分抗氧化酶在SA调控果实成熟衰老过程中发挥了作用，而对其在基因水平上对果实生长发育、成熟衰老过程中ROS水平的调控机制还鲜有报导。SODs是由多个基因家族成员编码的，各个家族成员可能在不同组织的不同发育时期发挥作用，它们的表达被不同的内外界因素所调控[11]。虽然一些研究人员已经成功在如章毛、小麦、拟南芥、荷花等植物中鉴定及分离出了SOD基因，但只有少数研究发表过对SOD基因家族的描述。因此，通过对桃果实中SOD基因家族的研究可以进一步了解哪些家族成员基因在果实的成熟衰老过程有着高表达量并起到关键的调控作用[15]。
本研究通过研究桃果实在低温贮藏下SODs在基因表达和酶活性两个层面变化来阐明SOD在桃果实成熟过程中对ROS的调控机制，为生产实践中包括桃果实保鲜技术的开发提供指导作用。
2. 材料与方法
2.1材料
2.1.1 实验药物与试剂
磷酸缓冲溶液；盐酸羟胺；EDTA；α萘胺；对氨基苯磺酸；无水乙醚；丙酮；TCA；TBA。
2.1.2 实验仪器与设备
锥形瓶 蜀牛玻璃仪器有限公司；
量筒 蜀牛玻璃仪器有限公司；
净化工作台 苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；
精密电子天平（DJ300 北京赛多利斯仪器系统有限公司 上海）；
高速冷冻离心机（GL20GⅡ 上海安亭科学仪器厂 上海）；
微型旋涡混合仪（XW80A 上海沪西分析仪器厂有限公司 上海）；
紫外可见分光光度计（WFJ UV2802 PC 尤尼柯(上海)仪器有限公司 上海）；
电泳仪（DYY10C 北京市六一仪器厂 北京）；
PCR仪（2720 Theral Cycler Applied Biosystems）；
台面式pH/ISE测试仪（Orion86802 上海纳锘仪器有限公司 美国）。
2.2实验方法
2.2.1原料的选取
实验采用的桃果实（品种：霞晖5号）采自江苏省农科院桃园，采后立即运回实验室，充分散去田间热后，选择大小均匀、果形齐整、无病虫害、无机械损伤且成熟度相同的果实为实验材料。并置于4℃下贮藏5周。
2.2.2呼吸活力及乙烯释放测定
在对二氧化碳和乙烯的测定中，每次将5个果实放入2L密封罐中，在20℃下放置1h，进行5次平行试验。在测定时吸取1ml的二氧化碳和5ml的乙烯，并用气相色谱进行分析。
2.2.3超氧阴离子、过氧化氢的测定
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Keywords3
1.前言3
2 材料与方法4
2.1 材料4
2.1.1 实验药物与试剂4
2.1.2 实验仪器与设备4
2.2方法5
2.2.1 实验原料5
2.2.2呼吸活力及乙烯释放测定5
2.2.3超氧阴离子，过氧化氢的测定5
2.2.4 SOD酶活测定 6
2.2.5 RNA的提取及实时荧光定量PCR分析 6
2.2.6 数据分析6
3 结果分析6
3.1乙烯产量分析6
3.2 呼吸活力分析7
3.3 过氧化氢分析7
3.4 超氧阴离子分析7
3.5 桃果实中SOD家族8
4讨论9
致谢 10
参考文献 11
桃果实成熟期间SOD基因表达水平
引言
1.前言
果实的成熟衰老一直被看作是一个极其复杂的过程，对于呼吸跃变型的果实而言，其成熟衰老的过程中往往伴随着呼吸越变高峰及乙烯的大量生成。并在越变过后，随着果实的继续成熟，呼吸速率也呈现出稳定的下降趋势[1]。与此同时，果实的成熟衰老过程也可以看做一个氧化的现象，在这过程中通过一系列的转化从而产生氧自由基(ROS)，如单线态氧(1O2)，超氧阴离子(O2)，过氧化氢(H2O2)，羟基
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氧(HO)等等。在近几年对植物生理的研究中已经证实ROS具有双重作用，一方面它是有氧代谢过程中所产生的毒害分子，而另一方面它也是植物生长，发育，成熟衰老以及防御途径中的一个关键调控因子。然而，当ROS 过量产生时，它则会通过氧化对维持细胞完整性起关键性作用的分子来直接对细胞的功能产生影响，从而引起细胞死亡。因此通过抗氧化系统来调节ROS的产生和清除使其保持在一个稳态水平上是至关重要的[17]。
SOD是由多个同源蛋白组成的抗氧化酶类，它们构成了抵御ROS的第一道防线，是最为重要的一类抗氧化酶，其能够催化O2发生歧化作用生成氧气和过氧化氢，在保护组织免受受ROS危害上扮演了重要作用[2]。SOD可根据其金属辅助因子和/或亚细胞分布情况进行分类，植物中SOD的主要形式包括线粒体MnSOD，细胞溶质Cu/ZnSOD，叶绿体Cu/ZnSOD以及铁FeSOD。此外，植物SOD还被定位于过氧化物酶体、乙醛酸循环体、液泡、核及细胞外基质等多个细胞器中。植物中SOD基因的表达受生长和环境因素的调节，包括激素、光强度、温度、UV和干旱等等。许多研究已经证实其在种子萌发、叶片衰老和抗胁迫方面均有极其重要的作用，而在果实成熟衰老的研究方面，Qin等对采后桃果实的线粒体蛋白的研究指出，随着果实衰老的进程，氧化胁迫会加重,引起MnSOD表达量及活性的紊乱,进而刺激了ROS的积累，不断升高的ROS可能使其他相关蛋白更容易羰基化，从而加速了果实的衰老[6]。Chan等人对经水杨酸（SA）采后处理过的桃果实进行蛋白质组学研究发现，GPX、CAT、SOD等6个抗氧化蛋白表达出现。了显著差异，表明了部分抗氧化酶在SA调控果实成熟衰老过程中发挥了作用，而对其在基因水平上对果实生长发育、成熟衰老过程中ROS水平的调控机制还鲜有报导。SODs是由多个基因家族成员编码的，各个家族成员可能在不同组织的不同发育时期发挥作用，它们的表达被不同的内外界因素所调控[11]。虽然一些研究人员已经成功在如章毛、小麦、拟南芥、荷花等植物中鉴定及分离出了SOD基因，但只有少数研究发表过对SOD基因家族的描述。因此，通过对桃果实中SOD基因家族的研究可以进一步了解哪些家族成员基因在果实的成熟衰老过程有着高表达量并起到关键的调控作用[15]。
本研究通过研究桃果实在低温贮藏下SODs在基因表达和酶活性两个层面变化来阐明SOD在桃果实成熟过程中对ROS的调控机制，为生产实践中包括桃果实保鲜技术的开发提供指导作用。
2. 材料与方法
2.1材料
2.1.1 实验药物与试剂
磷酸缓冲溶液；盐酸羟胺；EDTA；α萘胺；对氨基苯磺酸；无水乙醚；丙酮；TCA；TBA。
2.1.2 实验仪器与设备
锥形瓶 蜀牛玻璃仪器有限公司；
量筒 蜀牛玻璃仪器有限公司；
净化工作台 苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；
精密电子天平（DJ300 北京赛多利斯仪器系统有限公司 上海）；
高速冷冻离心机（GL20GⅡ 上海安亭科学仪器厂 上海）；
微型旋涡混合仪（XW80A 上海沪西分析仪器厂有限公司 上海）；
紫外可见分光光度计（WFJ UV2802 PC 尤尼柯(上海)仪器有限公司 上海）；
电泳仪（DYY10C 北京市六一仪器厂 北京）；
PCR仪（2720 Theral Cycler Applied Biosystems）；
台面式pH/ISE测试仪（Orion86802 上海纳锘仪器有限公司 美国）。
2.2实验方法
2.2.1原料的选取
实验采用的桃果实（品种：霞晖5号）采自江苏省农科院桃园，采后立即运回实验室，充分散去田间热后，选择大小均匀、果形齐整、无病虫害、无机械损伤且成熟度相同的果实为实验材料。并置于4℃下贮藏5周。
2.2.2呼吸活力及乙烯释放测定
在对二氧化碳和乙烯的测定中，每次将5个果实放入2L密封罐中，在20℃下放置1h，进行5次平行试验。在测定时吸取1ml的二氧化碳和5ml的乙烯，并用气相色谱进行分析。
2.2.3超氧阴离子、过氧化氢的测定
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