鸡蛋膜水解物对重金属诱导脂质过氧化的保护作用
摘要：鸡蛋膜（ESM）是一种纤维状薄膜，从蛋壳中分离得到，其含有胶原蛋白、角蛋白等，具有多种生物活性。本实验研究了鸡蛋膜水解物（ESMH）对亚铁的螯合率及其分别在卵黄、亚油酸体系中对重金属诱导的脂质过氧化的保护作用，拟为进一步的研究奠定基础。研究表明，鸡蛋膜水解物具有一定的抗氧化活性。在卵黄及亚油酸体系中，鸡蛋膜水解物均能有效抑制Fe2+诱导的脂质过氧化。当鸡蛋膜水解物质量浓度为20 mg/mL时，对亚铁诱导的卵黄脂质过氧化的抑制率为71.71%；当鸡蛋膜水解物质量浓度为5 mg/mL时，对亚铁诱导的亚油酸脂质过氧化的抑制率为43.34%。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1.1 材料 2
1.2 方法 2
1.2.1 铁螯合率测定 2
1.2.2 鸡蛋膜水解物对卵黄脂质过氧化的抑制作用 2
1.2.3 鸡蛋膜水解物对亚油酸脂质过氧化的抑制作用 3
1.3 统计学方法 3
2 结果与分析 3
2.1 铁螯合率测定 3
2.2 鸡蛋膜水解物对卵黄脂质过氧化的抑制作用 4
2.2.1 “ESMH+Fe2++卵黄”模式 4
2.2.2 “ESMH+卵黄+Fe2+”模式 5
2.3 鸡蛋膜水解物对亚油酸脂质过氧化的抑制作用 7
3 讨论 7
致谢 8
参考文献 8
鸡蛋膜水解物对重金属诱导脂质过氧化的保护作用
引言
引言
脂质过氧化可引起食品产生化学变质，同时自由基作用于不饱和脂肪酸发生脂质过氧化，使细胞膜功能受到影响，导致多种组织发生变化及其细胞发生异常[1]。脂质过氧化过程分为三个阶段：反应链的启动、链的延伸及链的终止[2]。脂质过氧化易发生在位于细胞膜的基团上，从而导致碳链的氧化、断裂甚至缩短，并会释放如丙二醛等产物。这些改变会导致细胞膜上的亲疏水结构发生改变[3]，从而使脂质微环境如膜上的膜蛋白、膜受体及其通道等变化，引起功能障碍，导致多种
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疾病，如脑血管等疾病，危害人体健康状况。
重金属是诱导脂质过氧化的一大因素，其可促进ROS产生，具细胞毒性。高剂量的重金属积累在细胞内，将会使细胞发生氧化应激而出现损伤。陈一玲等研究发现，铁在人体中执行各种生理功能（氧的传递、电子传递、酶催化）的同时，可以激发体内自由基的产生，引发脂质过氧化[4]。因此，在研究重金属对生物体危害的时候，对重金属诱导的脂质过氧化进行研究很有必要。
2002年张梦寒等采用正交试验法，研究了在卵磷脂脂质体中，肌肽对其氧化作用的抑制作用。结果表明，对于亚铁离子诱发的脂质过氧化反应，各浓度肌肽均能有效表现出抑制作用[5]。2009年郭红英采用小鼠肝脏自发性脂质氧化模型，测定其中丙二醛（MDA）含量，并以此来反映麦胚多肽对其脂质过氧化的抑制作用。实验结果发现：当多肽质量浓度为2 mg/mL时，对脂质过氧化的抑制率为52.05％[6]。
鸡蛋膜（ESM）是位于鸡蛋壳与鸡蛋清之间的纤维状薄膜，其含有角蛋白、胶原蛋白、糖蛋白等多种生物活性物质[7]，具有止咳止血[8]、复原伤口[9]、美容功效[10]、抗氧化[11]等作用。由于鸡蛋膜水溶性非常差，故对其抗氧化应用相对较少，大多鸡蛋膜都以厨余垃圾弃用，对环境造成了一定的污染，同时，浪费了大量蛋白资源。因此，研究开发鸡蛋膜生物活性是很有必要的。
1995年，Kakoki等以3:1的比例将鸡蛋膜与NaOH/C2H5OH混合，40℃的条件下，反应5h，过滤、中和后，再经过透析得到，这便是鸡蛋膜水解液，再按一定比例与生育酚混合，测定结果表明该鸡蛋膜水解物具有很强的抗氧化功效，其效果比单独使用生育酚的效果更优越[12]。2009年，周艳华等将鸡蛋膜通过酸溶解，得到可溶性蛋壳膜蛋白，再通过酶解，制得了鸡蛋膜抗氧化肽，通过测定表明，其抗氧化活性高于其他原料酶解多肽[13]。最新研究发现，鸡蛋膜水解物可以抑制细胞内脂质氧化程度，减少脂质过氧化产生的损伤[14]。
本实验以鸡蛋膜及鸡蛋膜水解物（ESMH）为原料，硫酸亚铁为铁源，比较两者对于亚铁离子在溶液中的螯合效果，并进行其在卵黄及亚油酸体系中对脂质过氧化的抑制作用，同时对其抑制脂质过氧化的机理展开讨论，为挖掘鸡蛋膜的生物活性提供理论依据，也为鸡蛋膜在食品、化妆品等领域的应用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料及仪器设备
1.1.1 材料
鸡蛋：购于南京铁匠营苏果店；
鸡蛋膜及鸡蛋膜水解物由实验室前期实验制备；
亚油酸、硫代巴比妥酸（triobarbituric acid，TBA）、三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）、硫酸亚铁、硫酸亚铁、抗坏血酸、NaOH、盐酸、无水乙醇,为国产分析纯。
1.1.2 仪器设备
电子天平：型号BSA223S，北京赛多利斯仪器系统有限公司；紫外分光光度计：UV2102PC；HH系列数显恒温水浴锅：XMTD3302，国华电器有限公司；台式冷冻离心机：Beckman Allegra 64R；漩涡混合器：Vortexgenie 2。
1.2 方法
1.2.1 铁螯合率测定
配制浓度梯度硫酸亚铁于510 nm处测定吸光度，得到标准曲线。用0.1 mol/L的PBS（pH 4）配制1 mL不同浓度的样品溶液与固定浓度的亚铁溶液混合，再加入与亚铁质量比为0.15：1的抗坏血酸，用10%的HCl或NaOH调节pH至4，于室温下混合，反应 30 min，离心后的上清液用无水乙醇处理（体积比为1：6），得到沉淀，加入10 mL的PBS溶解后于510 nm处测定吸光度，计算铁螯合率[15]。
式中，m1为螯合物中铁的质量（mg）；
m0为加入反应体系中铁的总质量（mg）。
1.2.2 鸡蛋膜水解物对卵黄脂质过氧化的抑制作用
卵黄悬液的制备：取一个新鲜鸡蛋去卵清得卵黄，移取卵黄并向其中加入5 mL PBS配制成1：1的悬液，震荡搅拌10 min，再加入PBS，稀释成1：25的卵黄悬液，置于4℃冰箱待用[16]。
Fe2+诱导卵黄脂质过氧化反应：“ESMH+Fe2++卵黄”模式：向一定量的鸡蛋膜水解物中加入1 mL的PBS（pH 7.4，0.1mol/L），加入25 mmol/L的FeSO4溶液0.2 mL，混匀，再加入卵黄悬液0.2 mL，最后用PBS定容至2 mL，混匀，置于37℃水浴30 min，取反应液1 mL，加入1 mL 10%的TCA，混匀，静置10 min，然后加入1 mL 0.67%的TBA，充分混匀，沸水浴15 min，室温冷却，用力震荡，1 min后于8000 r/min离心，将上清液于波长532 nm处比色测吸光值A，计算抑制率。模型管加等体积的蛋黄悬液，用等体积的蒸馏水代替FeSO4溶液；空白管不加FeSO4溶液。用不同浓度的EDTA及Vc作对照。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1.1 材料 2
1.2 方法 2
1.2.1 铁螯合率测定 2
1.2.2 鸡蛋膜水解物对卵黄脂质过氧化的抑制作用 2
1.2.3 鸡蛋膜水解物对亚油酸脂质过氧化的抑制作用 3
1.3 统计学方法 3
2 结果与分析 3
2.1 铁螯合率测定 3
2.2 鸡蛋膜水解物对卵黄脂质过氧化的抑制作用 4
2.2.1 “ESMH+Fe2++卵黄”模式 4
2.2.2 “ESMH+卵黄+Fe2+”模式 5
2.3 鸡蛋膜水解物对亚油酸脂质过氧化的抑制作用 7
3 讨论 7
致谢 8
参考文献 8
鸡蛋膜水解物对重金属诱导脂质过氧化的保护作用
引言
引言
脂质过氧化可引起食品产生化学变质，同时自由基作用于不饱和脂肪酸发生脂质过氧化，使细胞膜功能受到影响，导致多种组织发生变化及其细胞发生异常[1]。脂质过氧化过程分为三个阶段：反应链的启动、链的延伸及链的终止[2]。脂质过氧化易发生在位于细胞膜的基团上，从而导致碳链的氧化、断裂甚至缩短，并会释放如丙二醛等产物。这些改变会导致细胞膜上的亲疏水结构发生改变[3]，从而使脂质微环境如膜上的膜蛋白、膜受体及其通道等变化，引起功能障碍，导致多种
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疾病，如脑血管等疾病，危害人体健康状况。
重金属是诱导脂质过氧化的一大因素，其可促进ROS产生，具细胞毒性。高剂量的重金属积累在细胞内，将会使细胞发生氧化应激而出现损伤。陈一玲等研究发现，铁在人体中执行各种生理功能（氧的传递、电子传递、酶催化）的同时，可以激发体内自由基的产生，引发脂质过氧化[4]。因此，在研究重金属对生物体危害的时候，对重金属诱导的脂质过氧化进行研究很有必要。
2002年张梦寒等采用正交试验法，研究了在卵磷脂脂质体中，肌肽对其氧化作用的抑制作用。结果表明，对于亚铁离子诱发的脂质过氧化反应，各浓度肌肽均能有效表现出抑制作用[5]。2009年郭红英采用小鼠肝脏自发性脂质氧化模型，测定其中丙二醛（MDA）含量，并以此来反映麦胚多肽对其脂质过氧化的抑制作用。实验结果发现：当多肽质量浓度为2 mg/mL时，对脂质过氧化的抑制率为52.05％[6]。
鸡蛋膜（ESM）是位于鸡蛋壳与鸡蛋清之间的纤维状薄膜，其含有角蛋白、胶原蛋白、糖蛋白等多种生物活性物质[7]，具有止咳止血[8]、复原伤口[9]、美容功效[10]、抗氧化[11]等作用。由于鸡蛋膜水溶性非常差，故对其抗氧化应用相对较少，大多鸡蛋膜都以厨余垃圾弃用，对环境造成了一定的污染，同时，浪费了大量蛋白资源。因此，研究开发鸡蛋膜生物活性是很有必要的。
1995年，Kakoki等以3:1的比例将鸡蛋膜与NaOH/C2H5OH混合，40℃的条件下，反应5h，过滤、中和后，再经过透析得到，这便是鸡蛋膜水解液，再按一定比例与生育酚混合，测定结果表明该鸡蛋膜水解物具有很强的抗氧化功效，其效果比单独使用生育酚的效果更优越[12]。2009年，周艳华等将鸡蛋膜通过酸溶解，得到可溶性蛋壳膜蛋白，再通过酶解，制得了鸡蛋膜抗氧化肽，通过测定表明，其抗氧化活性高于其他原料酶解多肽[13]。最新研究发现，鸡蛋膜水解物可以抑制细胞内脂质氧化程度，减少脂质过氧化产生的损伤[14]。
本实验以鸡蛋膜及鸡蛋膜水解物（ESMH）为原料，硫酸亚铁为铁源，比较两者对于亚铁离子在溶液中的螯合效果，并进行其在卵黄及亚油酸体系中对脂质过氧化的抑制作用，同时对其抑制脂质过氧化的机理展开讨论，为挖掘鸡蛋膜的生物活性提供理论依据，也为鸡蛋膜在食品、化妆品等领域的应用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料及仪器设备
1.1.1 材料
鸡蛋：购于南京铁匠营苏果店；
鸡蛋膜及鸡蛋膜水解物由实验室前期实验制备；
亚油酸、硫代巴比妥酸（triobarbituric acid，TBA）、三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）、硫酸亚铁、硫酸亚铁、抗坏血酸、NaOH、盐酸、无水乙醇,为国产分析纯。
1.1.2 仪器设备
电子天平：型号BSA223S，北京赛多利斯仪器系统有限公司；紫外分光光度计：UV2102PC；HH系列数显恒温水浴锅：XMTD3302，国华电器有限公司；台式冷冻离心机：Beckman Allegra 64R；漩涡混合器：Vortexgenie 2。
1.2 方法
1.2.1 铁螯合率测定
配制浓度梯度硫酸亚铁于510 nm处测定吸光度，得到标准曲线。用0.1 mol/L的PBS（pH 4）配制1 mL不同浓度的样品溶液与固定浓度的亚铁溶液混合，再加入与亚铁质量比为0.15：1的抗坏血酸，用10%的HCl或NaOH调节pH至4，于室温下混合，反应 30 min，离心后的上清液用无水乙醇处理（体积比为1：6），得到沉淀，加入10 mL的PBS溶解后于510 nm处测定吸光度，计算铁螯合率[15]。
式中，m1为螯合物中铁的质量（mg）；
m0为加入反应体系中铁的总质量（mg）。
1.2.2 鸡蛋膜水解物对卵黄脂质过氧化的抑制作用
卵黄悬液的制备：取一个新鲜鸡蛋去卵清得卵黄，移取卵黄并向其中加入5 mL PBS配制成1：1的悬液，震荡搅拌10 min，再加入PBS，稀释成1：25的卵黄悬液，置于4℃冰箱待用[16]。
Fe2+诱导卵黄脂质过氧化反应：“ESMH+Fe2++卵黄”模式：向一定量的鸡蛋膜水解物中加入1 mL的PBS（pH 7.4，0.1mol/L），加入25 mmol/L的FeSO4溶液0.2 mL，混匀，再加入卵黄悬液0.2 mL，最后用PBS定容至2 mL，混匀，置于37℃水浴30 min，取反应液1 mL，加入1 mL 10%的TCA，混匀，静置10 min，然后加入1 mL 0.67%的TBA，充分混匀，沸水浴15 min，室温冷却，用力震荡，1 min后于8000 r/min离心，将上清液于波长532 nm处比色测吸光值A，计算抑制率。模型管加等体积的蛋黄悬液，用等体积的蒸馏水代替FeSO4溶液；空白管不加FeSO4溶液。用不同浓度的EDTA及Vc作对照。
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