一种新型纤维素酶的筛选和表达(附件)
本实验主要通过七叶苷显色法从已构建的云南土壤微生物宏基因组文库中筛选出纤维素酶阳性克隆体，并对其进行体外异源表达。从云南土壤微生物库中筛选出编号为963的阳性克隆体，通过序列分析获得产纤维素酶基因YNBG3，将其成功进行体外异源表达。利用宏基因组技术可以发掘非培养微生物中的纤维素酶基因。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 实验材料2
1.1.1 实验样品2
1.1.2 培养基2
1.1.3 酶及生化试剂2
1.1.4菌株和载体3
1.1.5 实验仪器3
1.2 实验方法3
1.2.1 云南土壤宏基因组文库纤维素酶活性筛选3
1.2.2 质粒的提取3
1.2.3亚克隆的制备4
1.2.4 目的基因的获取和测序4
1.2.5 目的基因的引物设计与合成5
1.2.6 目的基因的PCR合成 5
1.2.7 克隆载体和载体的酶切和回收5
1.2.8 连接6
1.2.9 感受态的制备6
1.2.10 纤维素酶重组子的筛选及鉴定6
1.2.11 重组子的验证6
1.2.12 菌种的保存 6
1.2.13 重组子的诱导表达6
1.2.14 粗酶液的收集7
1.2.15 纤维素酶的亲和层析7
1.2.16 纯化蛋白的SDSPAGE凝胶检测7
2 结果与分析7
2.1 纤维素酶活性克隆菌株的筛选8
2.2 纤维素酶基因的PCR扩增8
2.3 克隆产物和表达載体的双酶切9
2.4 纤维素酶重组子的鉴定10
2.5 纯化蛋白的SDSPAGE凝胶检测10
2.6 纤维素酶蛋白浓度的确定11
3 结果与展望11
致谢12
参考文献13
一种新型纤维素酶的筛选和表达 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
食品科学与工程 戚毓敏
引言
随着经济的发展和生产、生活水平的进步，社会面临能源短缺和环境污染等问题也越发加剧，传统资源如煤炭、石油等不可再生资源对环境破坏严重，而且随着时间的推移，数量也越来越少，开发一种新型环保的资源显得格外重要，纤维素作为宝贵的自然资源之一，清洁环保，在能源利用方面起着重要的作用，同时纤维素在食品、药学等领域也发挥着重要作用[16]。纤维素主要由植物的光合作用产生，同时人们生产生活也会产生大量的纤维素，如稻草、秸秆、果壳等，因为目前生产和利用纤维素的技术存在一定局限，绝大部分的纤维素往往作为废弃物被抛弃而不能被充分利用。其中的主要原因是纤维素是高分子物质，需要被分解为单糖后才能充分应用于生产生活。因此研究者越来越多得将研究重点放在纤维素酶上。
纤维素酶能将高分子的纤维素水解成单糖，进而发酵成为乙醇，并且纤维素酶反应条件温和，特异性高，如果能够充分利用，会在环境保护，资源利用等方面将起着重要作用。研究表明，纤维素酶主要是由微生物代谢产生的，因此分离纯化产纤维素酶的微生物成为众多研究者研究纤维素的重要步骤。一直以来研究者会选择从样品中分离出能够利用纤维素的微生物，将这些微生物进行纯培养，再从其体内提取纤维素酶的方式发现新的纤维素酶。但是目前自然界中大部分微生物不能通过纯培养的方式分离获得，因此利用纯培养方法筛选出的产纤维素酶的微生物种类比较单一，重复率也相当高，不利于人们对纤维素酶的发现及利用。
宏基因组学作为一种新技术，不需要传统的微生物分离培养技术，因此也越来越受到研究者的器重，该技术能避开纯培养技术，可以直接研究收集到的微生物的基因组。所谓宏基因组学(etagenomics)，也叫元基因组学，是把样品中的所有的微生物全部的DNA为筛选对象， 为其研究手段为目的基因的筛选和(或)序列的测序和分析[710]。该技术的第一步是从样品中提取所有微生物所有的DNA，而后把这些提取的DNA片段连接到适合的载体上，例如大肠杆菌等，然后进行转化，从而构建一个重组的DNA文库，再从这些文库菌中通过筛选得到目的基因。宏基因组学对研究复杂环境中的微生物群落组成及其代谢产物具有重要意义，极大得扩充了微生物基因来源，增大了微生物基因资源的利用的几率，这也使得新的活性产物的发现频率大大增加。宏基因组学将会极大的帮助研究者在利用和探索基因资源等方面不断取得新的突破。通过宏基因组与其他技术相结合的方法，可以加快从环境微生物中发现天然产物的速度，对生产生活有重要意义。
目前利用宏基因组方法筛选目的基因的方法主要有两种，一种是通过表型筛选;另一类则是通过序列的筛选。大多数的产物都是采用表型筛选所得，表型筛选也叫功能筛选，它不需要通过对库中的基因进行序列分析，筛选到的基因可能与已知的序列相似性较低，因此通过表型筛选是从宏基因组组获取的目的基因的主要方式。
通过宏基因组技术可以开发新酶，目前通过宏基因组开发的新酶的数量越来越多，说明该技术对新酶的发现有重要的价值，目前在食品方向比较受研究者关注的酶主要是脂酶和碳水化合物水解酶。本实验开发的新酶属于碳水化合物水解酶中的纤维素酶，纤维素酶可以应用于果汁开发，利用纤维素酶可以大大增加出汁率，提高产量。
本实验主要从云南土壤微生物基因组文库中分离获得纤维素酶高产菌株，采用七叶苷显色法，从基因组文库中筛选纤维素酶产生菌，七叶苷显色法的主要原理是：七叶苷在纤维素酶的催化作用下能将纤维素水解成葡萄糖和七叶苷原，七叶苷原能和 Fe3+发生呈色反应，颜色为棕黑色[11]，本实验主要采用柠檬酸铁铵作为Fe3+的来源。七叶苷显色技术可应于纤维素酶产生菌株的筛选。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 实验材料2
1.1.1 实验样品2
1.1.2 培养基2
1.1.3 酶及生化试剂2
1.1.4菌株和载体3
1.1.5 实验仪器3
1.2 实验方法3
1.2.1 云南土壤宏基因组文库纤维素酶活性筛选3
1.2.2 质粒的提取3
1.2.3亚克隆的制备4
1.2.4 目的基因的获取和测序4
1.2.5 目的基因的引物设计与合成5
1.2.6 目的基因的PCR合成 5
1.2.7 克隆载体和载体的酶切和回收5
1.2.8 连接6
1.2.9 感受态的制备6
1.2.10 纤维素酶重组子的筛选及鉴定6
1.2.11 重组子的验证6
1.2.12 菌种的保存 6
1.2.13 重组子的诱导表达6
1.2.14 粗酶液的收集7
1.2.15 纤维素酶的亲和层析7
1.2.16 纯化蛋白的SDSPAGE凝胶检测7
2 结果与分析7
2.1 纤维素酶活性克隆菌株的筛选8
2.2 纤维素酶基因的PCR扩增8
2.3 克隆产物和表达載体的双酶切9
2.4 纤维素酶重组子的鉴定10
2.5 纯化蛋白的SDSPAGE凝胶检测10
2.6 纤维素酶蛋白浓度的确定11
3 结果与展望11
致谢12
参考文献13
一种新型纤维素酶的筛选和表达 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
食品科学与工程 戚毓敏
引言
随着经济的发展和生产、生活水平的进步，社会面临能源短缺和环境污染等问题也越发加剧，传统资源如煤炭、石油等不可再生资源对环境破坏严重，而且随着时间的推移，数量也越来越少，开发一种新型环保的资源显得格外重要，纤维素作为宝贵的自然资源之一，清洁环保，在能源利用方面起着重要的作用，同时纤维素在食品、药学等领域也发挥着重要作用[16]。纤维素主要由植物的光合作用产生，同时人们生产生活也会产生大量的纤维素，如稻草、秸秆、果壳等，因为目前生产和利用纤维素的技术存在一定局限，绝大部分的纤维素往往作为废弃物被抛弃而不能被充分利用。其中的主要原因是纤维素是高分子物质，需要被分解为单糖后才能充分应用于生产生活。因此研究者越来越多得将研究重点放在纤维素酶上。
纤维素酶能将高分子的纤维素水解成单糖，进而发酵成为乙醇，并且纤维素酶反应条件温和，特异性高，如果能够充分利用，会在环境保护，资源利用等方面将起着重要作用。研究表明，纤维素酶主要是由微生物代谢产生的，因此分离纯化产纤维素酶的微生物成为众多研究者研究纤维素的重要步骤。一直以来研究者会选择从样品中分离出能够利用纤维素的微生物，将这些微生物进行纯培养，再从其体内提取纤维素酶的方式发现新的纤维素酶。但是目前自然界中大部分微生物不能通过纯培养的方式分离获得，因此利用纯培养方法筛选出的产纤维素酶的微生物种类比较单一，重复率也相当高，不利于人们对纤维素酶的发现及利用。
宏基因组学作为一种新技术，不需要传统的微生物分离培养技术，因此也越来越受到研究者的器重，该技术能避开纯培养技术，可以直接研究收集到的微生物的基因组。所谓宏基因组学(etagenomics)，也叫元基因组学，是把样品中的所有的微生物全部的DNA为筛选对象， 为其研究手段为目的基因的筛选和(或)序列的测序和分析[710]。该技术的第一步是从样品中提取所有微生物所有的DNA，而后把这些提取的DNA片段连接到适合的载体上，例如大肠杆菌等，然后进行转化，从而构建一个重组的DNA文库，再从这些文库菌中通过筛选得到目的基因。宏基因组学对研究复杂环境中的微生物群落组成及其代谢产物具有重要意义，极大得扩充了微生物基因来源，增大了微生物基因资源的利用的几率，这也使得新的活性产物的发现频率大大增加。宏基因组学将会极大的帮助研究者在利用和探索基因资源等方面不断取得新的突破。通过宏基因组与其他技术相结合的方法，可以加快从环境微生物中发现天然产物的速度，对生产生活有重要意义。
目前利用宏基因组方法筛选目的基因的方法主要有两种，一种是通过表型筛选;另一类则是通过序列的筛选。大多数的产物都是采用表型筛选所得，表型筛选也叫功能筛选，它不需要通过对库中的基因进行序列分析，筛选到的基因可能与已知的序列相似性较低，因此通过表型筛选是从宏基因组组获取的目的基因的主要方式。
通过宏基因组技术可以开发新酶，目前通过宏基因组开发的新酶的数量越来越多，说明该技术对新酶的发现有重要的价值，目前在食品方向比较受研究者关注的酶主要是脂酶和碳水化合物水解酶。本实验开发的新酶属于碳水化合物水解酶中的纤维素酶，纤维素酶可以应用于果汁开发，利用纤维素酶可以大大增加出汁率，提高产量。
本实验主要从云南土壤微生物基因组文库中分离获得纤维素酶高产菌株，采用七叶苷显色法，从基因组文库中筛选纤维素酶产生菌，七叶苷显色法的主要原理是：七叶苷在纤维素酶的催化作用下能将纤维素水解成葡萄糖和七叶苷原，七叶苷原能和 Fe3+发生呈色反应，颜色为棕黑色[11]，本实验主要采用柠檬酸铁铵作为Fe3+的来源。七叶苷显色技术可应于纤维素酶产生菌株的筛选。
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