海藻酸钠冻融凝胶蛋白质控释研究
摘要：本课题采用了冷冻-解冻（冻融法）制备了海藻酸钠凝胶，并考察了海藻酸钠流变学性质和释放蛋白质的性质。这种方法形成的水凝胶很适合被用来控释蛋白质或者多肽成分，因为其不需要添加多余的胶凝剂或者其他辅助试剂，在这个体系中也不存在其他残余的单体成分，此外，该方法也避免了加热对蛋白质可能造成的不可逆变性的影响。BSA作为一种蛋白模型药品，被包裹进了海藻酸钠中。在pH5的条件下，经过一个冻融循环海藻酸钠溶液未能成胶，而在pH4及pH3.5的条件下均能形成凝胶，同时凝胶强度与pH值成负相关，两者在550nm下的的透光率分别为11.39%及11.89%。在模拟胃液及模拟肠液的消化液释放试验中，模拟胃液条件下，凝胶很好的保护了蛋白质，在120min内基本未释放蛋白质；而在模拟肠液条件下，30min内包裹的蛋白质均被释放了出来，凝胶强度越大，缓释效果越好。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
材料与方法2
材料与仪器2
1.1.1 材料 2
1.1.2 试验仪器2
1.2 试验方法 2
1.2.1海藻酸钠冻融凝胶的制备2
1.2.2 凝胶结构性状观察2
1.2.3 凝胶透光率测定2
1.2.4 凝胶流变学研究2
1.2.5 蛋白质控释研究2
2结果与分析3
2.1 凝胶结构性状观察3
2.2 凝胶透光率测定3
2.3 凝胶流变学研究4
2.4 蛋白质控释研究5
3 讨论6
致谢6
参考文献6
图1不同pH值BSA海藻酸钠溶液在未经冻融循环及一个冻融循环后的状态3
图2BSA海藻酸钠溶液在不同pH值下的透光率4
图 3 10℃条件下不同BSA海藻酸钠溶液角频率与贮能模量和损耗模量的关系 5
图4 37℃条件下模拟胃液和肠液中的蛋白控释 6
海藻酸钠冻融凝胶蛋白质控释研究
引言
引言
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
如今，市场上已经出现了很多种的药物，而其中一部分是蛋白质类的药物，这类食品或者药品在经过消化道时，一般会被胃中含有的酶分解而变性失效。如果需要保护药品，则只能选择注射的方式，但注射对患者的伤害又是较大的，所以开发出一种可以保护蛋白质类药物的载体是十分必要的[1]。
现已有很多文章报导了运用高分子物质来控制蛋白质释放[24]。这些体系在特定的组织中一般可以有效地延长蛋白质的释放过程及蛋白质的循环半衰期；而在许多治疗性蛋白的试管释放试验中，海藻酸钠又被列为最有效地缓释材料之一[5]。
海藻酸钠是一种由αL古洛糖醛酸（G）和βD甘露糖醛酸（M）单体通过糖苷键形成的多糖分子，一般情况下海藻酸钠通过与二价金属离子螯合，使海藻酸钠分子交联，形成经典的蛋盒模型，许多海藻酸钠链继续互相交联从而成胶；或者是在pH值低于pKa时通过分子间相互作用形成凝胶[5]，而传统方法中一般会有一些人为的添加剂。早期报道集中高分子材料在冻融过程中可以形成水凝胶主要为一种人工合成的高分子聚乙烯醇（PVA)[6]。将15%的PVA水溶液在20℃冷冻24 h,然后在23℃解冻，可在PVA分子内部形成微晶区交联点，因此可得到强度较好的PVA水凝胶[3]。大多数研究认为微晶区结构是靠氢键作用力来维持，但也有研究认为是共价化学键在整个结构中起了主要作用[7]。除了聚乙烯醇以外，在其它天然高分子中也发现了冻融过程中可以形成凝胶的现象。黄原胶[8]，决明胶[9]，刺槐豆胶[10]，羧甲基纤维素，β葡聚糖[11]，琼脂糖，甚至是淀粉和麦芽糊精也能在特定的条件下都能形成冻融凝胶[12]。本研究是将蛋白质包裹于海藻酸钠凝胶中，然后调整复合体系的pH值，使两者的复合物在冻融过程中形成了凝胶，从而包裹了在其中的蛋白质，并延缓了蛋白质的释放过程，从而达到保护蛋白质的效果。
本实验中，根据了N.A. Peppas的研究团队及[13]一些人[14]研究出来了一种基于冻融循环对PVA形成水凝胶的物理交联方法，并且参照了Jia Kui Lia等人对该方法进行的改进[1]，运用了采用24℃冷冻24h，4℃条件下融化24h的方法使BSA海藻酸钠溶液形成凝胶。当体系在24℃条件下缓慢冻结形成凝胶网络结构，再在4℃条件解冻后，体系非常稳定，
较普通方法，一般运用来包裹蛋白质的材料中，难免会加入一些乳化剂等物质来稳定体系状态，这对于蛋白质后期的释放是一个很大的阻碍。因此，通过冻融而形成的凝胶状态比较稳定，同时不需要添加其他的物质。
本文将从凝胶状态、透光率、流变学、蛋白质的释放几方面来进行研究。
1 材料与方法
1．1 材料与仪器
1．1．1 材料
海藻酸钠（中等分子量）购买自Sigma公司，牛血清蛋白(BSA)来源于Solarbio。
1．1．2 试验仪器
恒温摇床（LSHZ300型，太仓市实验设备厂），离心机，紫外分光光度计（北京莱伯泰科仪器有限公司），磁力搅拌器（Fisher），真空干燥箱（DZG6021型，上海森信实验有限公司），恒温水浴锅（HH6型，江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司），电子天平（BSA224SCW型，赛多利斯科学仪器有限公司）流变仪，冰箱（DWYL270型,中科美菱有限公司）。
1．2 试验方法
1．2．1 海藻酸钠冻融凝胶的制备
将海藻酸钠（5g）溶解在400mL水中，然后把50mL溶解有500mg牛血清蛋白的水溶液与海藻酸钠溶液混合均匀，放入真空干燥仪中脱气，然后将其定容至500mL，得到的溶液为含有1%的海藻酸钠并且含有1mg/mL的牛血清蛋白。将其分成三份100mL，并分别调节其pH至5、4.5及3.5。然后将海藻酸钠与蛋白质的混合物置于24℃的环境下冷冻24h，再将其取出置于4℃的环境下放置24小时待其解冻。对照组的海藻酸钠则直接置4℃环境下48h。
1．2．2 凝胶结构性状观察
将解冻后的海藻酸钠与对照组的海藻酸钠进行对比观察，观察其颜色，物理性状。
1．2．3 凝胶透光率测定
将调好pH的海藻酸钠混合物分别用分光光度计测定其在520nm下的透光率，每组分别测量三次取平均值，并加减标准差。
1．2．4 凝胶流变学研究
将制作好的凝胶及其对照组在流变仪上测定其角频率与贮能模量损失模量的关系。转子型号为PP50，测定间隙为1mm，测定温度为10℃，扫描范围为0.1到100s。
1．2．5 蛋白质控释研究
蛋白质控释研究中，参考了M. Minekus 等人[15]的方法，将冻融组的三个pH的BSA海藻酸钠溶液分别加入与凝胶量相等的SGF(simulated gastric fluid ), SIF(simulated intestinal fluid)缓冲液。然后将样品放入摇床中，在37℃，100r/min的条件下培养，对于加入SGF缓冲液的样品，分别在10min，20min，30min， 60min，90min，120min时，取出样品，吸取0.1mL上清液，用BCA方法测量其中蛋白质含量，观察其中蛋白质释放情况。另一组先加入与BSA海藻酸钠溶液量相等的SIF缓冲液，在37℃摇床上培养，分别在2min，5min，10min，15min，20min，30min，时，按照前一组方法，进行测定其中蛋白质。最后将结果绘图，每个点基于三次测量，并作出标准差线。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
材料与方法2
材料与仪器2
1.1.1 材料 2
1.1.2 试验仪器2
1.2 试验方法 2
1.2.1海藻酸钠冻融凝胶的制备2
1.2.2 凝胶结构性状观察2
1.2.3 凝胶透光率测定2
1.2.4 凝胶流变学研究2
1.2.5 蛋白质控释研究2
2结果与分析3
2.1 凝胶结构性状观察3
2.2 凝胶透光率测定3
2.3 凝胶流变学研究4
2.4 蛋白质控释研究5
3 讨论6
致谢6
参考文献6
图1不同pH值BSA海藻酸钠溶液在未经冻融循环及一个冻融循环后的状态3
图2BSA海藻酸钠溶液在不同pH值下的透光率4
图 3 10℃条件下不同BSA海藻酸钠溶液角频率与贮能模量和损耗模量的关系 5
图4 37℃条件下模拟胃液和肠液中的蛋白控释 6
海藻酸钠冻融凝胶蛋白质控释研究
引言
引言
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
如今，市场上已经出现了很多种的药物，而其中一部分是蛋白质类的药物，这类食品或者药品在经过消化道时，一般会被胃中含有的酶分解而变性失效。如果需要保护药品，则只能选择注射的方式，但注射对患者的伤害又是较大的，所以开发出一种可以保护蛋白质类药物的载体是十分必要的[1]。
现已有很多文章报导了运用高分子物质来控制蛋白质释放[24]。这些体系在特定的组织中一般可以有效地延长蛋白质的释放过程及蛋白质的循环半衰期；而在许多治疗性蛋白的试管释放试验中，海藻酸钠又被列为最有效地缓释材料之一[5]。
海藻酸钠是一种由αL古洛糖醛酸（G）和βD甘露糖醛酸（M）单体通过糖苷键形成的多糖分子，一般情况下海藻酸钠通过与二价金属离子螯合，使海藻酸钠分子交联，形成经典的蛋盒模型，许多海藻酸钠链继续互相交联从而成胶；或者是在pH值低于pKa时通过分子间相互作用形成凝胶[5]，而传统方法中一般会有一些人为的添加剂。早期报道集中高分子材料在冻融过程中可以形成水凝胶主要为一种人工合成的高分子聚乙烯醇（PVA)[6]。将15%的PVA水溶液在20℃冷冻24 h,然后在23℃解冻，可在PVA分子内部形成微晶区交联点，因此可得到强度较好的PVA水凝胶[3]。大多数研究认为微晶区结构是靠氢键作用力来维持，但也有研究认为是共价化学键在整个结构中起了主要作用[7]。除了聚乙烯醇以外，在其它天然高分子中也发现了冻融过程中可以形成凝胶的现象。黄原胶[8]，决明胶[9]，刺槐豆胶[10]，羧甲基纤维素，β葡聚糖[11]，琼脂糖，甚至是淀粉和麦芽糊精也能在特定的条件下都能形成冻融凝胶[12]。本研究是将蛋白质包裹于海藻酸钠凝胶中，然后调整复合体系的pH值，使两者的复合物在冻融过程中形成了凝胶，从而包裹了在其中的蛋白质，并延缓了蛋白质的释放过程，从而达到保护蛋白质的效果。
本实验中，根据了N.A. Peppas的研究团队及[13]一些人[14]研究出来了一种基于冻融循环对PVA形成水凝胶的物理交联方法，并且参照了Jia Kui Lia等人对该方法进行的改进[1]，运用了采用24℃冷冻24h，4℃条件下融化24h的方法使BSA海藻酸钠溶液形成凝胶。当体系在24℃条件下缓慢冻结形成凝胶网络结构，再在4℃条件解冻后，体系非常稳定，
较普通方法，一般运用来包裹蛋白质的材料中，难免会加入一些乳化剂等物质来稳定体系状态，这对于蛋白质后期的释放是一个很大的阻碍。因此，通过冻融而形成的凝胶状态比较稳定，同时不需要添加其他的物质。
本文将从凝胶状态、透光率、流变学、蛋白质的释放几方面来进行研究。
1 材料与方法
1．1 材料与仪器
1．1．1 材料
海藻酸钠（中等分子量）购买自Sigma公司，牛血清蛋白(BSA)来源于Solarbio。
1．1．2 试验仪器
恒温摇床（LSHZ300型，太仓市实验设备厂），离心机，紫外分光光度计（北京莱伯泰科仪器有限公司），磁力搅拌器（Fisher），真空干燥箱（DZG6021型，上海森信实验有限公司），恒温水浴锅（HH6型，江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司），电子天平（BSA224SCW型，赛多利斯科学仪器有限公司）流变仪，冰箱（DWYL270型,中科美菱有限公司）。
1．2 试验方法
1．2．1 海藻酸钠冻融凝胶的制备
将海藻酸钠（5g）溶解在400mL水中，然后把50mL溶解有500mg牛血清蛋白的水溶液与海藻酸钠溶液混合均匀，放入真空干燥仪中脱气，然后将其定容至500mL，得到的溶液为含有1%的海藻酸钠并且含有1mg/mL的牛血清蛋白。将其分成三份100mL，并分别调节其pH至5、4.5及3.5。然后将海藻酸钠与蛋白质的混合物置于24℃的环境下冷冻24h，再将其取出置于4℃的环境下放置24小时待其解冻。对照组的海藻酸钠则直接置4℃环境下48h。
1．2．2 凝胶结构性状观察
将解冻后的海藻酸钠与对照组的海藻酸钠进行对比观察，观察其颜色，物理性状。
1．2．3 凝胶透光率测定
将调好pH的海藻酸钠混合物分别用分光光度计测定其在520nm下的透光率，每组分别测量三次取平均值，并加减标准差。
1．2．4 凝胶流变学研究
将制作好的凝胶及其对照组在流变仪上测定其角频率与贮能模量损失模量的关系。转子型号为PP50，测定间隙为1mm，测定温度为10℃，扫描范围为0.1到100s。
1．2．5 蛋白质控释研究
蛋白质控释研究中，参考了M. Minekus 等人[15]的方法，将冻融组的三个pH的BSA海藻酸钠溶液分别加入与凝胶量相等的SGF(simulated gastric fluid ), SIF(simulated intestinal fluid)缓冲液。然后将样品放入摇床中，在37℃，100r/min的条件下培养，对于加入SGF缓冲液的样品，分别在10min，20min，30min， 60min，90min，120min时，取出样品，吸取0.1mL上清液，用BCA方法测量其中蛋白质含量，观察其中蛋白质释放情况。另一组先加入与BSA海藻酸钠溶液量相等的SIF缓冲液，在37℃摇床上培养，分别在2min，5min，10min，15min，20min，30min，时，按照前一组方法，进行测定其中蛋白质。最后将结果绘图，每个点基于三次测量，并作出标准差线。
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