uvb对发芽大豆异黄酮积累的促进作用
摘要：明确NO对UV-B胁迫下发芽大豆异黄酮合成的影响。本试验以发芽大豆为材料，研究了UV-B胁迫下诱发的NO事件与异黄酮积累间的关系。结果表明：UV-B处理后，发芽大豆中NO水平、异黄酮含量及异黄酮合成的关键酶（PAL、CHI、CHS和IFS）奥活性均得以上调，上述效果可被NO专一性淬灭剂cPTIO抑制，而此抑制效果可被外源NO供体SNP所逆转。因此UV-B处理诱发的发芽大豆机体内产生的NO介导了异黄酮合成。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1.1 材料培养及处理方式 2
1.2 试验方法 2
1.2.1 生理生化指标的测定 2
1.2.2 异黄酮含量的测定 4
1.2.3 异黄酮合成的关键酶活性的测定 4
1.2.4 NO含量的测定 4
2 结果与分析 4
2.1 紫外光对发芽大豆异黄酮合成的促进作用研究 4
2.1.1 UVB处理对发芽大豆生理生化指标的影响 4
2.1.2 UVB处理对发芽大豆异黄酮合成的促进作用 7
2.2 NO对UVB胁迫下发芽大豆中异黄酮积累中的信号转导作用 9
2.2.1 UVB胁迫对发芽大豆内源NO水平的影响 9
2.2.2 UVB胁迫对发芽大豆中异黄酮含量及其合成关键酶活性的影响 10
3 讨论 11
4 结论 12
致谢 12
参考文献： 12
UVB对发芽大豆异黄酮积累的促进作用
引言
异黄酮是高等植物中苯丙烷类代谢途径的分支所形成的一类次生代谢产物，其在豆科植物中含量丰富。异黄酮对人体具有雌激素特性、抗癌、降低心血管疾病发生率及调控免疫应答[1]等多种生理作用。在植物体内异黄酮具有抵御逆境胁迫、抵抗微生物侵染、作为昆虫拒食剂及促进根瘤菌趋化、生长繁殖、根瘤发育和固氮[2]等作用。然而从植物中提取的异黄酮含量较低，大豆(Glycine max)及其制品中仅含异黄酮0.2~1
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
.6 mgg1(DW)[3]，因而采用生物转化技术提高植物中异黄酮含量，可进一步扩大异黄酮的应用范围。近年来，随着人类生活水平的不断提高和工业产业的迅速发展，导致地球生物圈大气平流层中的臭氧浓度降低，到达地球表面的紫外光UVB辐射明显增加。高等植物体内一个重要的抗UVB胁迫反应为表皮组织中吸收紫外光UVB化合物的物质的合成积累，在受到紫外光UVB胁迫的早期合成积累次生代谢产物是大多数植物共有的特性[4]，异黄酮类物质是细胞苯丙烷代谢通路上的一种重要代谢产物，而苯丙烷途径本身就是一条非常重要的防御性次级代谢途径，因而异黄酮类次生代谢产物的合成积累在植物对紫外光UVB胁迫的应答过程中起着至关重要的作用。
相关研究表明UVB胁迫可在转录水平上对异黄酮合成进行调节：UVB照射数小时可刺激拟南芥细胞培养物中异黄酮合成的关键酶查尔酮合酶CHS基因的转录与表达[5]。而UVB胁迫逆境胁迫诱导次生代谢产物的合成积累的过程需要植物外源信号分子的介导，其中新型信号分子NO扮演着重要的角色。例如NO在哺乳动物调亡基因Bax诱导长春花细胞中生物碱合成积累、真菌衍生物脑苷脂诱发紫杉醇细胞中紫杉醇产生、低聚糖诱导青嵩毛状根中青嵩素的合成积累[6]等过程中均起着必要作用。徐茂军等研究结果证明NO在臭氧诱导银杏细胞中黄酮合成积累的过程中起重要的信号转导作用。NO参与高压胁迫诱发金丝桃细胞中金丝桃素的合成积累过程[7]，上述研究报道进一步证实，NO在植物体内次生代谢产物合成积累的过程中起着至关重要的作用，因此，不难想到NO可能也是紫外光UVB胁迫诱导植物体内异黄酮合成积累的重要信号分子，研究NO在植物次生代谢产物合成中的生物调控作用，不仅有助于了解NO的生物学功能及作用机理，更有助于认识植物次生代谢的调控规律。目前关于NO在UVB诱导次生代谢产物合成积累过程中所扮演的角色及其作用机理的报道很少，在发芽大豆中的相关研究报道更是鲜见。
本试验以发芽大豆为材料，研究了紫外光UVB胁迫对发芽叶内源NO产生和异黄酮合成积累的影响；NO在介导UVB诱发发芽大豆合成抗紫外次生产物异黄酮合成积累中的作用。
1 材料与方法
1.1 材料培养及处理方式
大豆籽粒经挑选、除杂后，用1%的次氯酸钠溶液表面消毒30min，紧接着用去离子水冲洗籽粒至pH中性，其后于30±1℃条件下用去离子水浸泡吸水8h；将浸泡后大豆置于发芽机于30℃发芽，分别设以下处理：
（1）对照：黑暗发芽（去离子水）
（2）0.5mM CPTIO处理
（3）UVB胁迫处理（去离子水）
（4）UVB胁迫处理（0.5mM CPTIO）
（5）UVB胁迫处理（0.5mM CPTIO+SNP）
1.2 试验方法
1.2.1 生理生化指标的测定
1.2.1.1芽长的测定
样品弃子叶取芽，刻度尺测量芽长。
1.2.1.2 丙二醛（MDA）含量的测定[8]
取样品1g，10mlTCA研磨，匀浆在4000r/min离心10分钟，上清液为样品提取液。吸取离心的上清液2ml（对照加2ml蒸馏水），加入2ml 0.6%硫代巴比妥酸溶液，混匀物于沸水浴上反应15min，迅速冷却后再离心。取上清液测定450nm、532nm和600nm波长下的吸光度。
1.2.1.3 脯氨酸含量的测定[8]
称取样品0.5g，加入5ml 3%磺基水杨酸溶液，在沸水浴中提取10min，冷却后离心取上清液，即为脯氨酸提取液。
吸取2ml提取液于带玻塞试管中，加入2ml冰醋酸及2ml 2.5%酸性茚三酮试剂，在沸水浴中加热30min，溶液即成红色。冷却后加入4ml甲苯，摇荡30s，静置片刻，吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色皿中，以甲苯溶液为空白对照，在570nm波长处测定吸光度（A）值。
1.2.1.4 超氧化物歧化酶（SOD）活性测定
试剂的配制
（1）0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)：
A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO412H2O（分子量358.14）71.7g；
B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO42H2O（分子量156.01）31.2g。
分别用蒸馏水定容到1000ml。
0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na2HPO4) 228.75ml，B母液(NaH2PO4) 21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。
（2）14.5mM甲硫氨酸溶液：取2.1637g Met用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至1000ml。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1.1 材料培养及处理方式 2
1.2 试验方法 2
1.2.1 生理生化指标的测定 2
1.2.2 异黄酮含量的测定 4
1.2.3 异黄酮合成的关键酶活性的测定 4
1.2.4 NO含量的测定 4
2 结果与分析 4
2.1 紫外光对发芽大豆异黄酮合成的促进作用研究 4
2.1.1 UVB处理对发芽大豆生理生化指标的影响 4
2.1.2 UVB处理对发芽大豆异黄酮合成的促进作用 7
2.2 NO对UVB胁迫下发芽大豆中异黄酮积累中的信号转导作用 9
2.2.1 UVB胁迫对发芽大豆内源NO水平的影响 9
2.2.2 UVB胁迫对发芽大豆中异黄酮含量及其合成关键酶活性的影响 10
3 讨论 11
4 结论 12
致谢 12
参考文献： 12
UVB对发芽大豆异黄酮积累的促进作用
引言
异黄酮是高等植物中苯丙烷类代谢途径的分支所形成的一类次生代谢产物，其在豆科植物中含量丰富。异黄酮对人体具有雌激素特性、抗癌、降低心血管疾病发生率及调控免疫应答[1]等多种生理作用。在植物体内异黄酮具有抵御逆境胁迫、抵抗微生物侵染、作为昆虫拒食剂及促进根瘤菌趋化、生长繁殖、根瘤发育和固氮[2]等作用。然而从植物中提取的异黄酮含量较低，大豆(Glycine max)及其制品中仅含异黄酮0.2~1
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
.6 mgg1(DW)[3]，因而采用生物转化技术提高植物中异黄酮含量，可进一步扩大异黄酮的应用范围。近年来，随着人类生活水平的不断提高和工业产业的迅速发展，导致地球生物圈大气平流层中的臭氧浓度降低，到达地球表面的紫外光UVB辐射明显增加。高等植物体内一个重要的抗UVB胁迫反应为表皮组织中吸收紫外光UVB化合物的物质的合成积累，在受到紫外光UVB胁迫的早期合成积累次生代谢产物是大多数植物共有的特性[4]，异黄酮类物质是细胞苯丙烷代谢通路上的一种重要代谢产物，而苯丙烷途径本身就是一条非常重要的防御性次级代谢途径，因而异黄酮类次生代谢产物的合成积累在植物对紫外光UVB胁迫的应答过程中起着至关重要的作用。
相关研究表明UVB胁迫可在转录水平上对异黄酮合成进行调节：UVB照射数小时可刺激拟南芥细胞培养物中异黄酮合成的关键酶查尔酮合酶CHS基因的转录与表达[5]。而UVB胁迫逆境胁迫诱导次生代谢产物的合成积累的过程需要植物外源信号分子的介导，其中新型信号分子NO扮演着重要的角色。例如NO在哺乳动物调亡基因Bax诱导长春花细胞中生物碱合成积累、真菌衍生物脑苷脂诱发紫杉醇细胞中紫杉醇产生、低聚糖诱导青嵩毛状根中青嵩素的合成积累[6]等过程中均起着必要作用。徐茂军等研究结果证明NO在臭氧诱导银杏细胞中黄酮合成积累的过程中起重要的信号转导作用。NO参与高压胁迫诱发金丝桃细胞中金丝桃素的合成积累过程[7]，上述研究报道进一步证实，NO在植物体内次生代谢产物合成积累的过程中起着至关重要的作用，因此，不难想到NO可能也是紫外光UVB胁迫诱导植物体内异黄酮合成积累的重要信号分子，研究NO在植物次生代谢产物合成中的生物调控作用，不仅有助于了解NO的生物学功能及作用机理，更有助于认识植物次生代谢的调控规律。目前关于NO在UVB诱导次生代谢产物合成积累过程中所扮演的角色及其作用机理的报道很少，在发芽大豆中的相关研究报道更是鲜见。
本试验以发芽大豆为材料，研究了紫外光UVB胁迫对发芽叶内源NO产生和异黄酮合成积累的影响；NO在介导UVB诱发发芽大豆合成抗紫外次生产物异黄酮合成积累中的作用。
1 材料与方法
1.1 材料培养及处理方式
大豆籽粒经挑选、除杂后，用1%的次氯酸钠溶液表面消毒30min，紧接着用去离子水冲洗籽粒至pH中性，其后于30±1℃条件下用去离子水浸泡吸水8h；将浸泡后大豆置于发芽机于30℃发芽，分别设以下处理：
（1）对照：黑暗发芽（去离子水）
（2）0.5mM CPTIO处理
（3）UVB胁迫处理（去离子水）
（4）UVB胁迫处理（0.5mM CPTIO）
（5）UVB胁迫处理（0.5mM CPTIO+SNP）
1.2 试验方法
1.2.1 生理生化指标的测定
1.2.1.1芽长的测定
样品弃子叶取芽，刻度尺测量芽长。
1.2.1.2 丙二醛（MDA）含量的测定[8]
取样品1g，10mlTCA研磨，匀浆在4000r/min离心10分钟，上清液为样品提取液。吸取离心的上清液2ml（对照加2ml蒸馏水），加入2ml 0.6%硫代巴比妥酸溶液，混匀物于沸水浴上反应15min，迅速冷却后再离心。取上清液测定450nm、532nm和600nm波长下的吸光度。
1.2.1.3 脯氨酸含量的测定[8]
称取样品0.5g，加入5ml 3%磺基水杨酸溶液，在沸水浴中提取10min，冷却后离心取上清液，即为脯氨酸提取液。
吸取2ml提取液于带玻塞试管中，加入2ml冰醋酸及2ml 2.5%酸性茚三酮试剂，在沸水浴中加热30min，溶液即成红色。冷却后加入4ml甲苯，摇荡30s，静置片刻，吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色皿中，以甲苯溶液为空白对照，在570nm波长处测定吸光度（A）值。
1.2.1.4 超氧化物歧化酶（SOD）活性测定
试剂的配制
（1）0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)：
A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO412H2O（分子量358.14）71.7g；
B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO42H2O（分子量156.01）31.2g。
分别用蒸馏水定容到1000ml。
0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na2HPO4) 228.75ml，B母液(NaH2PO4) 21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。
（2）14.5mM甲硫氨酸溶液：取2.1637g Met用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至1000ml。
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