猪肝多肽的制备及其活性研究
目 录
1 引言 1
1.1 肝脏蛋白的提取方法 1
1.2 多肽的制备与分离纯化 1
1.3 多肽的活性研究 2
1.4 研究的主要内容、目的和意义 2
2 猪肝蛋白的制备 4
2.1 材料与仪器 4
2.2 实验方法 5
2.3 结论 5
3 猪肝多肽的制备 6
3.1 材料与仪器 6
3.2 实验方法 7
3.3 DPPH自由基清除实验方法 8
3.4 结论 9
4 猪肝多肽的分离纯化 14
4.1 材料与仪器 14
4.2 离子交换层析 15
4.3 SephadexG-25 凝胶过滤层析 15
4.3 结论 15
5 多肽活性测定 17
5.1 材料和仪器 17
5.2 抗氧化性的测定 18
5.2 乳化度及乳化稳定性 18
5.3 起泡性及泡沫稳定性 19
5.4 结论 19
结 论 22
致 谢 24
参考文献 25
1 引言
猪肝作为猪屠宰后的最主要副产品之一，大约占猪体重的1.4%。猪肝的营养价值很高，并且有明目、补肝的功效，蛋白质含量丰富，脂质含量极少。其中含铁量是精瘦肉的18倍，维生素A的含量更是瘦肉含量的好几百倍，同时含有丰富的矿物质、微量元素和维生素。
猪是主要的家畜之一，因此猪肝毫无疑问具有很高的食用价值，对猪肝最常见的，最原始利用就是将其作为餐桌上的美食。但是由于其腥味较大，味甘略带苦涩，容易发生褐变从而影 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
响色泽，不少人尤其是小孩子十分排斥猪肝。但是由于其极高的营养价值，并且价格低廉易于获得，不少人开始研究对猪肝的深加工，拓展它的应用范围。在食用方面，最直接的是将猪肝预煮和加姜汁的方法去除苦腥味，改善口感[1]；等等，猪肝中含有的天然的营养素引起医药方面专家的注意，除了以猪肝为原料制造药物，从猪肝中提取的肝细胞生长素甚至可以用于临床治疗[2、3]；提取后的猪肝残余物更可以用于饲料工业虽然目前对猪肝的应用早已从食用扩展至其他用途，对其中营养素的应用也更加丰富。本文对猪肝中含量丰富的蛋白质进行研究，将其酶解得到多肽并研究它的活性。
1.1 肝脏蛋白的提取方法
对于不同的材料来源，我们要选择不同的容易提取纯化分离的方案。需要注意的是，应尽量多的提取出有活性的目的蛋白质，避免目的蛋白失活。材料往往需要预处理，使被提取物尽可能多的释放出来。大部分蛋白质溶于稀碱、稀盐、稀酸溶液和水，只有少数可以与脂肪结合的蛋白溶于乙醇等有机溶剂中。鉴于这一特性，我们可以采用不同的方法提取纯化并分离蛋白质。包括水溶液提取法[4、5]、有机溶剂提取法[6]、碱溶酸沉法[7]、蔗糖密度梯度离心法[8]、超声波萃取法[9]等等。
1.2 多肽的制备与分离纯化
多肽是源于蛋白质的一类多功能化合物，对人体健康起积极作用，是具有提高机体免疫力、延缓衰老和降血压、抗氧化等功能的特殊因子。现在获得多肽的途径非常多，主要包括这几种：（1）从天然生物体中直接获得天然多肽（2）将蛋白质水解分离获得多肽（3）通过化学合成、酶法合成[10、11]以及基因工程制得活性多肽[12]。但是天然多肽含量极少，大量提取十分困难，费时费料；合成法成本高并且伴随着有害副产物的产生虽然多肽来源、组成和功能各不相同，但是生产方法却很相似。不同的方法各有千秋，可以根据所需制备多肽的具体情况，选择适宜的生产方法。这其中，酶解法因其反应条件温和、催化位置有方向性等优点，使用更为普遍，同时，酶法生产安全性很高，能在温和的条件下以较短的生产时间进行定位水解分裂并产生大量的短肽，易于控制、价格低廉且易于推广，所以，这种方法是当前普遍采用的生产工艺，且更适合应用于实验室研究。
将制得的粗多肽进行分离纯化可以得到高效专一的活性多肽，最大化的利用原材料。分离纯化的方法根据原料、水解方法和待分离的产物的物理化学性质的不同而不同。目前分离纯化多肽的方法主要有高效液相色谱法、毛细管等电聚焦电泳法、离子交换色谱法、超滤法、SephadexG-25凝胶过滤层析法等等以及多种纯化方法联用[13、14、15]。
1.3 多肽的活性研究
1.3.1 抗氧化活性研究机理和方法
脂质氧化引起食物变色，风味、质地变差，营养价值降低[16]，为有效的防止或者减轻食物的脂质氧化，在食品中添加抗氧化剂是常见途径。抗氧化机理主要有：（1）清除自由基（2）淬灭单线态氧（3）金属离子发生螯合而不能形成活性物质或者加快脂肪过氧化（4）酶抗氧化剂减少脂类化合物氧化[17、18]（5）降低氧浓度。在油脂氧化途径中大体上都含有链引发、自由基传递、终止这三个阶段。羟基自由基在链引发阶段可以作为引发剂引起油脂的氧化，与此同时羟基自由基更是引发的反应产物之一。由此可以体现出，羟基自由基的清除能力很有可能是抗氧化剂的还原力、活性氧清除能力还有供氢能力的综合 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
表现，其结果的大小直接反映了抗氧化剂延迟油脂氧化诱导期开始的能力。在这篇实验中，我们采用DPPH自由基和羟基自由基清除实验来验证猪肝多肽的抗氧化活性。
1.3.2 其他活性
多肽因氨基酸组成和序列的不同具有很多种活性，除了上文提到的抗氧化性之外，还有降血压活性、免疫调节活性、降血脂、抗炎、抗菌活性、起泡性和乳化性等等，结合具体情况，我们研究了又多肽的乳化及乳化度稳定性和起泡性及泡沫稳定性。
1.4 研究的主要内容、目的和意义
目前大众对猪肝的印象大多停留在其食用价值，对猪肝中营养素的利用虽然也有，但大多是提取其中的肝细胞生长素应用于医药领域和临床治疗，对猪肝中蛋白质的研究较少，其实猪肝价格低廉易于获得且蛋白质含量丰富，是提取蛋白质的理想原料。我们的实验以新鲜猪肝作为研究对象，磷酸缓冲液为提取剂并结合硫酸铵分级沉淀的方法从猪肝中提取猪肝粗蛋白，将其酶解进一步制得猪肝多肽并对其活性进行体外研究，探究了提取条件影响猪肝蛋白的规律以及猪肝多肽的部分活性，为食品中天然抗氧化剂的添加和抗衰来等保健食品的开发提供科学依据。
1.4.1 主要内容
（1）采用磷酸盐缓冲液浸泡猪肝匀浆，结合硫酸铵分级沉淀的方法提取猪肝蛋白；
（2）选用中性蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶，分别在各自的最适条件下酶解猪肝蛋白，采用DPPH法测定各自的酶解物自由基清除率；
（3）选择上一步骤筛选出的最佳蛋白酶，以提取时间、提取温度、pH和加酶量为单因素，利用响应面法优化该蛋白酶的酶解条件；
（4）将最佳酶解条件下酶解得到的粗多肽经过离子交换层析和SephadexG-25凝胶过滤层析进行分离纯化，筛选出DPPH清除率最高的组用于活性测定；
（5）对猪肝多肽进行体外抗氧化活性测定、乳化度及乳化稳定性和起泡性和泡沫稳定性的测定。
1.4.2 目的和意义
研究出酶解猪肝多肽的最佳工艺，了解其部分活性，利用生物活性肽原料来源广泛，结构复杂多样的特点，结合多肽活性，用于清除自由基，抗菌和诱导肿瘤细胞凋亡，同时还有免疫调节等生理活性。将多肽用于医药领域，生产出在体内清除速度快的药物，利用工程菌获得表达产物
1 引言 1
1.1 肝脏蛋白的提取方法 1
1.2 多肽的制备与分离纯化 1
1.3 多肽的活性研究 2
1.4 研究的主要内容、目的和意义 2
2 猪肝蛋白的制备 4
2.1 材料与仪器 4
2.2 实验方法 5
2.3 结论 5
3 猪肝多肽的制备 6
3.1 材料与仪器 6
3.2 实验方法 7
3.3 DPPH自由基清除实验方法 8
3.4 结论 9
4 猪肝多肽的分离纯化 14
4.1 材料与仪器 14
4.2 离子交换层析 15
4.3 SephadexG-25 凝胶过滤层析 15
4.3 结论 15
5 多肽活性测定 17
5.1 材料和仪器 17
5.2 抗氧化性的测定 18
5.2 乳化度及乳化稳定性 18
5.3 起泡性及泡沫稳定性 19
5.4 结论 19
结 论 22
致 谢 24
参考文献 25
1 引言
猪肝作为猪屠宰后的最主要副产品之一，大约占猪体重的1.4%。猪肝的营养价值很高，并且有明目、补肝的功效，蛋白质含量丰富，脂质含量极少。其中含铁量是精瘦肉的18倍，维生素A的含量更是瘦肉含量的好几百倍，同时含有丰富的矿物质、微量元素和维生素。
猪是主要的家畜之一，因此猪肝毫无疑问具有很高的食用价值，对猪肝最常见的，最原始利用就是将其作为餐桌上的美食。但是由于其腥味较大，味甘略带苦涩，容易发生褐变从而影 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
响色泽，不少人尤其是小孩子十分排斥猪肝。但是由于其极高的营养价值，并且价格低廉易于获得，不少人开始研究对猪肝的深加工，拓展它的应用范围。在食用方面，最直接的是将猪肝预煮和加姜汁的方法去除苦腥味，改善口感[1]；等等，猪肝中含有的天然的营养素引起医药方面专家的注意，除了以猪肝为原料制造药物，从猪肝中提取的肝细胞生长素甚至可以用于临床治疗[2、3]；提取后的猪肝残余物更可以用于饲料工业虽然目前对猪肝的应用早已从食用扩展至其他用途，对其中营养素的应用也更加丰富。本文对猪肝中含量丰富的蛋白质进行研究，将其酶解得到多肽并研究它的活性。
1.1 肝脏蛋白的提取方法
对于不同的材料来源，我们要选择不同的容易提取纯化分离的方案。需要注意的是，应尽量多的提取出有活性的目的蛋白质，避免目的蛋白失活。材料往往需要预处理，使被提取物尽可能多的释放出来。大部分蛋白质溶于稀碱、稀盐、稀酸溶液和水，只有少数可以与脂肪结合的蛋白溶于乙醇等有机溶剂中。鉴于这一特性，我们可以采用不同的方法提取纯化并分离蛋白质。包括水溶液提取法[4、5]、有机溶剂提取法[6]、碱溶酸沉法[7]、蔗糖密度梯度离心法[8]、超声波萃取法[9]等等。
1.2 多肽的制备与分离纯化
多肽是源于蛋白质的一类多功能化合物，对人体健康起积极作用，是具有提高机体免疫力、延缓衰老和降血压、抗氧化等功能的特殊因子。现在获得多肽的途径非常多，主要包括这几种：（1）从天然生物体中直接获得天然多肽（2）将蛋白质水解分离获得多肽（3）通过化学合成、酶法合成[10、11]以及基因工程制得活性多肽[12]。但是天然多肽含量极少，大量提取十分困难，费时费料；合成法成本高并且伴随着有害副产物的产生虽然多肽来源、组成和功能各不相同，但是生产方法却很相似。不同的方法各有千秋，可以根据所需制备多肽的具体情况，选择适宜的生产方法。这其中，酶解法因其反应条件温和、催化位置有方向性等优点，使用更为普遍，同时，酶法生产安全性很高，能在温和的条件下以较短的生产时间进行定位水解分裂并产生大量的短肽，易于控制、价格低廉且易于推广，所以，这种方法是当前普遍采用的生产工艺，且更适合应用于实验室研究。
将制得的粗多肽进行分离纯化可以得到高效专一的活性多肽，最大化的利用原材料。分离纯化的方法根据原料、水解方法和待分离的产物的物理化学性质的不同而不同。目前分离纯化多肽的方法主要有高效液相色谱法、毛细管等电聚焦电泳法、离子交换色谱法、超滤法、SephadexG-25凝胶过滤层析法等等以及多种纯化方法联用[13、14、15]。
1.3 多肽的活性研究
1.3.1 抗氧化活性研究机理和方法
脂质氧化引起食物变色，风味、质地变差，营养价值降低[16]，为有效的防止或者减轻食物的脂质氧化，在食品中添加抗氧化剂是常见途径。抗氧化机理主要有：（1）清除自由基（2）淬灭单线态氧（3）金属离子发生螯合而不能形成活性物质或者加快脂肪过氧化（4）酶抗氧化剂减少脂类化合物氧化[17、18]（5）降低氧浓度。在油脂氧化途径中大体上都含有链引发、自由基传递、终止这三个阶段。羟基自由基在链引发阶段可以作为引发剂引起油脂的氧化，与此同时羟基自由基更是引发的反应产物之一。由此可以体现出，羟基自由基的清除能力很有可能是抗氧化剂的还原力、活性氧清除能力还有供氢能力的综合 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
表现，其结果的大小直接反映了抗氧化剂延迟油脂氧化诱导期开始的能力。在这篇实验中，我们采用DPPH自由基和羟基自由基清除实验来验证猪肝多肽的抗氧化活性。
1.3.2 其他活性
多肽因氨基酸组成和序列的不同具有很多种活性，除了上文提到的抗氧化性之外，还有降血压活性、免疫调节活性、降血脂、抗炎、抗菌活性、起泡性和乳化性等等，结合具体情况，我们研究了又多肽的乳化及乳化度稳定性和起泡性及泡沫稳定性。
1.4 研究的主要内容、目的和意义
目前大众对猪肝的印象大多停留在其食用价值，对猪肝中营养素的利用虽然也有，但大多是提取其中的肝细胞生长素应用于医药领域和临床治疗，对猪肝中蛋白质的研究较少，其实猪肝价格低廉易于获得且蛋白质含量丰富，是提取蛋白质的理想原料。我们的实验以新鲜猪肝作为研究对象，磷酸缓冲液为提取剂并结合硫酸铵分级沉淀的方法从猪肝中提取猪肝粗蛋白，将其酶解进一步制得猪肝多肽并对其活性进行体外研究，探究了提取条件影响猪肝蛋白的规律以及猪肝多肽的部分活性，为食品中天然抗氧化剂的添加和抗衰来等保健食品的开发提供科学依据。
1.4.1 主要内容
（1）采用磷酸盐缓冲液浸泡猪肝匀浆，结合硫酸铵分级沉淀的方法提取猪肝蛋白；
（2）选用中性蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶，分别在各自的最适条件下酶解猪肝蛋白，采用DPPH法测定各自的酶解物自由基清除率；
（3）选择上一步骤筛选出的最佳蛋白酶，以提取时间、提取温度、pH和加酶量为单因素，利用响应面法优化该蛋白酶的酶解条件；
（4）将最佳酶解条件下酶解得到的粗多肽经过离子交换层析和SephadexG-25凝胶过滤层析进行分离纯化，筛选出DPPH清除率最高的组用于活性测定；
（5）对猪肝多肽进行体外抗氧化活性测定、乳化度及乳化稳定性和起泡性和泡沫稳定性的测定。
1.4.2 目的和意义
研究出酶解猪肝多肽的最佳工艺，了解其部分活性，利用生物活性肽原料来源广泛，结构复杂多样的特点，结合多肽活性，用于清除自由基，抗菌和诱导肿瘤细胞凋亡，同时还有免疫调节等生理活性。将多肽用于医药领域，生产出在体内清除速度快的药物，利用工程菌获得表达产物
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