大叶冬青苦丁茶中咖啡酰奎尼酸类物质对脂肪消化、代谢相关酶的影响
大叶冬青苦丁茶中咖啡酰奎尼酸类物质对脂肪消化、代谢相关酶的影响[20200509182444]
摘要：本研究以大叶冬青苦丁茶中六种不同的咖啡酰奎尼酸类化合物（CQA）3-CQA、4-CQA、5-CQA、3，4-diCQA、3,5-diCQA、4,5-diCQA为抑制剂源，通过酶标仪微量法测定反应体系在波长405nm条件下的吸光值来确定其对胰脂肪酶的抑制作用，观察和分析不同咖啡酰奎尼酸类化合物对胰脂肪酶的抑制类型和机理。结果表明，六种咖啡酰奎尼酸类化合物均对胰脂肪酶有明显抑制作用，3-CQA、4-CQA、5-CQA、3，4-diCQA、3,5-diCQA、4,5-diCQA对胰脂肪酶的半抑制浓度分别为：0.470mg/mL、0.412mg/mL、0.417mg/mL、0.452mg/mL、0.393mg/mL、0.313mg/mL；抑制类型为竞争性抑制。该方法在一定范围内有良好线性，相关系数在0.8917-0.9993之间。大叶冬青苦丁茶中咖啡酰奎尼酸类物质可以通过抑制体内脂肪代谢相关酶的活性,减少机体对脂肪的分解、吸收,从而达到抗肥胖的效果。
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关键字:大叶冬青苦丁茶；咖啡酰奎尼酸；胰脂肪酶；抑制作用；抗肥胖
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1 材料与仪器3
1.1 材料 3
1.2 试剂与仪器 3
1.2.1 试剂3
1.2.2 仪器设备3
2 实验方法3
2.1 实验原理4
2.1.1 试剂配制4
2.1.2 确定适宜底物浓度4
2.1.3 大叶冬青苦丁茶中咖啡酰奎尼酸类物质对胰脂肪酶的抑制作用4
2.1.4 大叶冬青苦丁茶中咖啡酰奎尼酸类物质对胰脂肪酶的抑制类型研究4
3 结果与分析5
3.1 酶活定义及抑制率计算公式 5
3.2 胰脂肪酶催化反应的适宜底物浓度 5
3.3 大叶冬青苦丁茶中咖啡酰奎尼酸类物质对胰脂肪酶的抑制作用5
3.3.1 大叶冬青苦丁茶中咖啡酰奎尼酸类物质对胰脂肪酶的半抑制浓度5
3.3.2 可逆抑制类型研究8
3.3.2.1 产物浓度标准曲线确定8
3.3.2.2 可逆抑制类型研究9
4 讨论与小结 11
致谢12
参考文献12
大叶冬青苦丁茶中咖啡酰奎尼酸类物质对脂肪消化、代谢相关酶的影响
引言
引言
随着人们物质生活水平不断地提高,肥胖症的发病率呈现逐年上升,其预防和治疗对世界各国公共健康与预防医学提出了重大挑战。肥胖导致的胰岛素抵抗性，可引发身体多种代谢异常，造成高血脂症、动脉粥状硬化、心脑血管疾病、高血压、糖尿病、脂肪肝，严重危及人类健康。另外，肥胖也是引 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
发许多癌症的危险因子之一[1]。肥胖发生的原因是多方面的，如遗传因素、环境因素、饮食习惯等，其中高脂饮食是导致肥胖的重要原因。食物中的脂肪被水解成单酰甘油和游离的脂肪酸后，在胃肠道被吸收。然后在体内重新合成脂肪，造成脂肪堆积，最终导致肥胖。近年来，通过减少脂肪吸收而达到减肥已经成为有效治疗肥胖症的手段之一[2]。胰脂肪酶是一种由胰腺分泌的脂肪分解酶，在消化甘油三酯中起着重要作用。它可以消化食物中50％-70％膳食脂肪类[3]。因此应用脂肪酶抑制剂可有效抑制脂肪酶对脂肪的分解作用，从而达到减少脂肪吸收、控制和治疗肥胖的目的。目前从天然食物源中寻找能够有效降脂减肥的功能性成分已经成为肥胖预防与治疗研究领域的热点。
在目前研究的抗肥胖天然功能因子中,来源于植物的多酚类化合物具有很强的抗肥胖作用,以其健康、安全、高效而备受人们的青睐。研究发现它们能够有效地清除体内过剩的自由基、抑制脂质过氧化以及对自由基诱发的生物大分子损伤起到保护作用,从而能够很好地发挥抗氧化、抗肿瘤、抗动脉硬化、防治冠心病等心脑血管疾病以及抗菌等多种生理功能[4,5]。苦丁茶是一种纯天然植物代用茶，富含三菇及其皂普类、黄酮、氨基酸等活性物质，具有抗氧化、降脂、抗炎杀菌、减肥、降血压等多种药理功能[6-8]。在我国，主要的苦丁茶是利用冬青科树叶加工而成的苦丁茶和利用木犀科树叶加工而成的苦丁茶，而前者主要有苦丁茶冬青和大叶冬青（两者通称冬青苦丁茶）。最近刘丽香等[9,10]分析了苦丁茶冬青苦丁茶的多酚含量和抗氧化活性，结果表明苦丁茶具有较高的多酚含量和较强的抗氧化能力；王晴川等[11]利用半制备高效液相色谱（HPLC）分析方法从苦丁冬青苦丁茶中分离纯化得到6种咖啡酰奎尼酸(Caffeoylquinic acid, CQA)类化合物，即绿原酸（3-CQA）、隐绿原酸（4-CQA）、新绿原酸（5-CQA）、4,5-O-二咖啡酰奎尼酸（4,5-diCQA）、3,5-O-二咖啡酰奎尼酸（3,5-diCQA）和3,4-O-二咖啡酰奎尼酸（3,4-diCQA）。
CQA类化合物是一类由奎尼酸和不同数目的咖啡酸缩合而成的酚酸类天然化合物[12]，广泛存在于金银花、苍耳、山楂、苹果、咖啡等植物中[13,14]，从植物中提取得到的CQA及其衍生物被证明具有不同程度的生理、药理功能，如抗氧化活性、抗炎活性、酶抑制作用、肝细胞保护作用等。张文芹等[15]实验证明苦丁冬青苦丁茶多酚类物质初提物在体外表现出很强的抑制胰脂肪酶活性的作用，本研究是基于前期的工作基础，通过体外酶学实验，对大叶冬青苦丁茶中6种咖啡酰奎尼酸类物质在体外对脂肪代谢、消化相关酶的抑制作用和抑制机理进行研究。明确苦丁茶的降脂减肥功效、作用途径、探讨其降脂减肥机理,可以为把苦丁茶开发成为天然高效的降脂减肥新产品提供理论依据与技术支撑；让广大消费者明白苦丁茶的降脂效果及作用机理,有利于促进苦丁茶的消费以及苦丁茶产业的发展。
图1 六种咖啡酰奎尼酸单体结构
Fig 1 The monomer structure of six caffeoylquinic acids
1 材料与仪器
1．1 材料
大叶冬青苦丁茶中咖啡酰奎尼酸类化合物5-CQA购自美国Sigma公司，3-CQA、4-CQA、3，4-diCQA、3,5-diCQA、4,5-diCQ *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
A购自成都普瑞法科技开发有限公司。
1．2 试剂与仪器
1．2．1 试剂
胰脂肪酶购自美国Sigma公司；
对硝基苯酚、对硝基苯基月桂酸酯购自日本Fluka公司；
Triton-100购自南京生兴生物技术有限公司；
三羟甲基氨基甲烷（Tris)、浓盐酸为国产分析纯；
乙醇、氯化钠为国产化学纯。
1．2．2 仪器设备
DELTA 320 pH计(德国 METTLER 公司)；
AY-120电子精密天平、BL-220H分析天平(日本Shimadzu)；
Synergy美国宝特-2酶标仪(美国BioTek公司)；
96孔细胞培养板(美国Coming公司)；
恒温培养箱(上海森信实验仪器有限公司）；
Anke TDL-5低速离心机(上海安亭科学仪器厂)。
2 实验方法
2．1 实验原理
大叶冬青苦丁茶多酚类物质对胰脂肪酶活性的抑制作用参照Gordon等[16]的方法。本实验选用胰脂肪酶为试验对象,pNP-Laurate (对硝基苯基月桂酸脂)为底物,根据胰脂酶能从pNP-Laurate中分解出对硝基苯酚,其溶液呈黄绿色，浓度与405-410nm处吸光值成正比的原理来探讨咖啡酰奎尼酸类物质对胰脂肪酶活性的抑制作用,实验结果由酶标仪微量法检测。酶标仪是酶联免疫测定的常规仪器,主要应用在医学领域。其测定的原理是建立在物质吸收光谱及可见光比色技术基础上的。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度[17]。本实验反应在1ml微量体系中，使用传统紫外分光光度计比色法很难检测到实验结果，而微量法检测蛋白含量和酶活力的原理、操作步骤、结果判定及酶单位定义与比色法一致,不同之处是将测定量等比例缩小,使之能在微孔中完成反应,最后以酶标仪读取吸光值。使用微量法测定,完全克服了比色法操作繁琐,试剂用量大,消耗时间长等弊端,并且微量法重复性优于比色法[18]。
摘要：本研究以大叶冬青苦丁茶中六种不同的咖啡酰奎尼酸类化合物（CQA）3-CQA、4-CQA、5-CQA、3，4-diCQA、3,5-diCQA、4,5-diCQA为抑制剂源，通过酶标仪微量法测定反应体系在波长405nm条件下的吸光值来确定其对胰脂肪酶的抑制作用，观察和分析不同咖啡酰奎尼酸类化合物对胰脂肪酶的抑制类型和机理。结果表明，六种咖啡酰奎尼酸类化合物均对胰脂肪酶有明显抑制作用，3-CQA、4-CQA、5-CQA、3，4-diCQA、3,5-diCQA、4,5-diCQA对胰脂肪酶的半抑制浓度分别为：0.470mg/mL、0.412mg/mL、0.417mg/mL、0.452mg/mL、0.393mg/mL、0.313mg/mL；抑制类型为竞争性抑制。该方法在一定范围内有良好线性，相关系数在0.8917-0.9993之间。大叶冬青苦丁茶中咖啡酰奎尼酸类物质可以通过抑制体内脂肪代谢相关酶的活性,减少机体对脂肪的分解、吸收,从而达到抗肥胖的效果。
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关键字:大叶冬青苦丁茶；咖啡酰奎尼酸；胰脂肪酶；抑制作用；抗肥胖
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1 材料与仪器3
1.1 材料 3
1.2 试剂与仪器 3
1.2.1 试剂3
1.2.2 仪器设备3
2 实验方法3
2.1 实验原理4
2.1.1 试剂配制4
2.1.2 确定适宜底物浓度4
2.1.3 大叶冬青苦丁茶中咖啡酰奎尼酸类物质对胰脂肪酶的抑制作用4
2.1.4 大叶冬青苦丁茶中咖啡酰奎尼酸类物质对胰脂肪酶的抑制类型研究4
3 结果与分析5
3.1 酶活定义及抑制率计算公式 5
3.2 胰脂肪酶催化反应的适宜底物浓度 5
3.3 大叶冬青苦丁茶中咖啡酰奎尼酸类物质对胰脂肪酶的抑制作用5
3.3.1 大叶冬青苦丁茶中咖啡酰奎尼酸类物质对胰脂肪酶的半抑制浓度5
3.3.2 可逆抑制类型研究8
3.3.2.1 产物浓度标准曲线确定8
3.3.2.2 可逆抑制类型研究9
4 讨论与小结 11
致谢12
参考文献12
大叶冬青苦丁茶中咖啡酰奎尼酸类物质对脂肪消化、代谢相关酶的影响
引言
引言
随着人们物质生活水平不断地提高,肥胖症的发病率呈现逐年上升,其预防和治疗对世界各国公共健康与预防医学提出了重大挑战。肥胖导致的胰岛素抵抗性，可引发身体多种代谢异常，造成高血脂症、动脉粥状硬化、心脑血管疾病、高血压、糖尿病、脂肪肝，严重危及人类健康。另外，肥胖也是引 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
发许多癌症的危险因子之一[1]。肥胖发生的原因是多方面的，如遗传因素、环境因素、饮食习惯等，其中高脂饮食是导致肥胖的重要原因。食物中的脂肪被水解成单酰甘油和游离的脂肪酸后，在胃肠道被吸收。然后在体内重新合成脂肪，造成脂肪堆积，最终导致肥胖。近年来，通过减少脂肪吸收而达到减肥已经成为有效治疗肥胖症的手段之一[2]。胰脂肪酶是一种由胰腺分泌的脂肪分解酶，在消化甘油三酯中起着重要作用。它可以消化食物中50％-70％膳食脂肪类[3]。因此应用脂肪酶抑制剂可有效抑制脂肪酶对脂肪的分解作用，从而达到减少脂肪吸收、控制和治疗肥胖的目的。目前从天然食物源中寻找能够有效降脂减肥的功能性成分已经成为肥胖预防与治疗研究领域的热点。
在目前研究的抗肥胖天然功能因子中,来源于植物的多酚类化合物具有很强的抗肥胖作用,以其健康、安全、高效而备受人们的青睐。研究发现它们能够有效地清除体内过剩的自由基、抑制脂质过氧化以及对自由基诱发的生物大分子损伤起到保护作用,从而能够很好地发挥抗氧化、抗肿瘤、抗动脉硬化、防治冠心病等心脑血管疾病以及抗菌等多种生理功能[4,5]。苦丁茶是一种纯天然植物代用茶，富含三菇及其皂普类、黄酮、氨基酸等活性物质，具有抗氧化、降脂、抗炎杀菌、减肥、降血压等多种药理功能[6-8]。在我国，主要的苦丁茶是利用冬青科树叶加工而成的苦丁茶和利用木犀科树叶加工而成的苦丁茶，而前者主要有苦丁茶冬青和大叶冬青（两者通称冬青苦丁茶）。最近刘丽香等[9,10]分析了苦丁茶冬青苦丁茶的多酚含量和抗氧化活性，结果表明苦丁茶具有较高的多酚含量和较强的抗氧化能力；王晴川等[11]利用半制备高效液相色谱（HPLC）分析方法从苦丁冬青苦丁茶中分离纯化得到6种咖啡酰奎尼酸(Caffeoylquinic acid, CQA)类化合物，即绿原酸（3-CQA）、隐绿原酸（4-CQA）、新绿原酸（5-CQA）、4,5-O-二咖啡酰奎尼酸（4,5-diCQA）、3,5-O-二咖啡酰奎尼酸（3,5-diCQA）和3,4-O-二咖啡酰奎尼酸（3,4-diCQA）。
CQA类化合物是一类由奎尼酸和不同数目的咖啡酸缩合而成的酚酸类天然化合物[12]，广泛存在于金银花、苍耳、山楂、苹果、咖啡等植物中[13,14]，从植物中提取得到的CQA及其衍生物被证明具有不同程度的生理、药理功能，如抗氧化活性、抗炎活性、酶抑制作用、肝细胞保护作用等。张文芹等[15]实验证明苦丁冬青苦丁茶多酚类物质初提物在体外表现出很强的抑制胰脂肪酶活性的作用，本研究是基于前期的工作基础，通过体外酶学实验，对大叶冬青苦丁茶中6种咖啡酰奎尼酸类物质在体外对脂肪代谢、消化相关酶的抑制作用和抑制机理进行研究。明确苦丁茶的降脂减肥功效、作用途径、探讨其降脂减肥机理,可以为把苦丁茶开发成为天然高效的降脂减肥新产品提供理论依据与技术支撑；让广大消费者明白苦丁茶的降脂效果及作用机理,有利于促进苦丁茶的消费以及苦丁茶产业的发展。
图1 六种咖啡酰奎尼酸单体结构
Fig 1 The monomer structure of six caffeoylquinic acids
1 材料与仪器
1．1 材料
大叶冬青苦丁茶中咖啡酰奎尼酸类化合物5-CQA购自美国Sigma公司，3-CQA、4-CQA、3，4-diCQA、3,5-diCQA、4,5-diCQ *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
A购自成都普瑞法科技开发有限公司。
1．2 试剂与仪器
1．2．1 试剂
胰脂肪酶购自美国Sigma公司；
对硝基苯酚、对硝基苯基月桂酸酯购自日本Fluka公司；
Triton-100购自南京生兴生物技术有限公司；
三羟甲基氨基甲烷（Tris)、浓盐酸为国产分析纯；
乙醇、氯化钠为国产化学纯。
1．2．2 仪器设备
DELTA 320 pH计(德国 METTLER 公司)；
AY-120电子精密天平、BL-220H分析天平(日本Shimadzu)；
Synergy美国宝特-2酶标仪(美国BioTek公司)；
96孔细胞培养板(美国Coming公司)；
恒温培养箱(上海森信实验仪器有限公司）；
Anke TDL-5低速离心机(上海安亭科学仪器厂)。
2 实验方法
2．1 实验原理
大叶冬青苦丁茶多酚类物质对胰脂肪酶活性的抑制作用参照Gordon等[16]的方法。本实验选用胰脂肪酶为试验对象,pNP-Laurate (对硝基苯基月桂酸脂)为底物,根据胰脂酶能从pNP-Laurate中分解出对硝基苯酚,其溶液呈黄绿色，浓度与405-410nm处吸光值成正比的原理来探讨咖啡酰奎尼酸类物质对胰脂肪酶活性的抑制作用,实验结果由酶标仪微量法检测。酶标仪是酶联免疫测定的常规仪器,主要应用在医学领域。其测定的原理是建立在物质吸收光谱及可见光比色技术基础上的。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度[17]。本实验反应在1ml微量体系中，使用传统紫外分光光度计比色法很难检测到实验结果，而微量法检测蛋白含量和酶活力的原理、操作步骤、结果判定及酶单位定义与比色法一致,不同之处是将测定量等比例缩小,使之能在微孔中完成反应,最后以酶标仪读取吸光值。使用微量法测定,完全克服了比色法操作繁琐,试剂用量大,消耗时间长等弊端,并且微量法重复性优于比色法[18]。
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