pksc基因的敲除对乳酸乳球菌n8产nisin的影响
摘要：乳酸链球菌素（Nisin）是一种高度翻译后修饰的细菌素，是由属于 N 血清型的某些乳酸链球菌产生的一种多肽物质，能够抑制部分革兰氏阳性菌的生长。Nisin 的生物合成与调控机制是一个复杂的网络机制，近年研究证明除 Nisin 生物合成基因簇中的11个基因外，有很多其他的基因参与其中，实验室前期研究表明，Nisin的产量与非核糖体肽合成相关基因pksC之间存在一定关系，即nisZ与pksC基因转录水平呈负相关，本实验通过 L. lactis N8中pksC基因的删除，实现非核糖体肽NRPs合成通路的阻断，提高核糖体肽Nisin合成利用胞内底物的效率，从而使Nisin的表达量明显提高，转录量提高约30%-40%。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 2
1 材料与方法 2
1．1 材料 2
1．1．3 引物 3
1．1．4 培养基及试剂配方 3
1．2 方法 3
1．2．1 重组质粒的构建 3
1．2．2 缺失菌株的筛选 4
1．2．3 缺失菌株与野生菌株生长曲线的测定 5
1．2．4 Nisin效价标准曲线的制作及不同菌株发酵上清液效价测定 5
1．2．5 缺失菌株与野生菌株nisZ转录量的测定 6
2 结果与分析 6
2．1 重组质粒构建 6
2．1．1 上下游同源臂融合 6
2．1．2 融合片段与pCS1966连接验证 7
2．2 缺失菌株的构建与验证 7
2．3 缺失菌株与原始菌株生长曲线的比较分析 8
2．4 Nisin效价标准曲线及不同菌株发酵上清液抑菌效果和效价比较 8
2．4．1 L. lactis N8和缺失菌株发酵上清液抑菌效果比较 8
2．4．2 Nisin效价标准曲线及不同菌株发酵上清液抑菌效价比较 9
2．5 缺失菌株与原始菌株nisZ转录水平的比较 10
3 讨论 11
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
/> 致谢 12
参考文献 13
pksC基因的敲除对乳酸乳球菌N8产Nisin的影响
食工111 符雨欣
引言
引言
乳酸菌(Lactic acid bacteria, LAB) 是一类能从可发酵碳水化合物 (主要指葡萄糖) 产生大量乳酸的革兰氏阳性细菌的统称，其特点为革兰氏染色阳性，细胞形态为杆菌或球菌，过氧化氢酶为阳性，消耗葡萄糖 50% 以上产生乳酸，不形成内生孢子，无运动性或很少。其中，对于食品酿造工业来说以链球菌属最为重要，特别是链球菌属中的乳球菌群，是乳制品、植物原料发酵食品中常见的菌，常在食品工业中使用。
许多乳酸菌除产生乳酸、乙酸和双乙酰外，还能产生细菌素。Nisin[1]就是其中一种高度翻译后修饰的细菌素，是由属于 N 血清型的某些乳酸链球菌产生的一种核糖体多肽物质。Nisin 可通过形成穿膜孔道引起胞内小分子物质外泄，从而抑制绝大多数革兰氏阳性菌[23]，其抑菌作用已在食品、药品等方面中得到了广泛的应用[45]。Nisin 的生物合成与调控机制是一个复杂的网络机制，目前研究最为清楚的为 Nisin A 和 Nisin Z[67]，二者唯一的区别是Nisin 第28 位氨基酸不同，分别为组氨酸与天冬酰胺。负责 Nisin A、Z 生物合成及调控的基因共有 11 个，nisA/ZBTCIPRKFEG[8]，它们成簇排列在一个约 70 kb 的转座子上，这些基因产物分别负责 Nisin 的翻译后修饰 (NisB 和 NisC)，Nisin 前体的转运 (NisT)，引导肽的剪切 (NisP)，免疫耐受性 (NisI 和 NisF，NisE，NisG)，Nisin 二组分应答调控系统 (NisR 和 NisK) [911]。Nisin 的生物合成过程及其中基因的细胞定位见图1[12]。近几年的研究证明，除 Nisin 生物合成基因簇中的11个基因外，还有很多其他的基因参与其中[13]。
图1 Nisin生物合成
Figure 1. Nisin biosynthesis.
Nisin是一种核糖体肽，即按照mRNA的指令，依靠核糖体将氨基酸合成多肽链。然而非核糖体肽NRPs，它与核糖体肽Nisin的合成存在氨基酸竞争关系。微生物利用NPRs，以非核糖体途径合成天然多肽，这些多肽是一系列低分子量的次级代谢产物，具有生物活性，可被用作抗生素、免疫抑制剂、抗癌和抗病毒因子、铁载体及生物表面活性剂等多肽的装配由NRPs 的多模块酶以硫模板机制完成[14]。
实验室前期研究表明，Nisin的产量与非核糖体肽合成相关基因pksC之间存在一定关系，即nisZ与pksC基因转录水平呈负相关，本实验通过pksC基因（1871bp）的删除，实现非核糖体肽NRPs合成通路的阻断，提高核糖体肽Nisin合成利用氨基酸的效率，从而进一步达到提高Nisin产量的目的。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 菌种及质粒 大肠杆菌 (Escherichia coliDH5α)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactisN8)、藤黄微球菌Micrococcus luteusA1NCIMB86166)、质粒 pCS1966 由本实验室保存。
1．1．2 主要试剂和仪器 实验中所用抗生素购自鼎国科技生物有限公司；限制性内切酶， DNAmarker，反转录试剂盒及PCR荧光定量试剂盒购自Takara公司；M17 肉汤、胰蛋白胨、酵母抽提物购自Oxoid 公司；抗生素 (红霉素)购自上海生工生物技术有限公司；蛋白胨、牛肉粉、琼脂粉购自北京奥星生物技术有限公司；葡萄糖、蔗糖、NaCl 购自天津化学试剂一厂；PCR 产物回收试剂盒，连接酶购自Fermentas公司；质粒快速小提试剂盒，细菌基因组提取试剂盒及RNA快速提取试剂盒购自天根生物科技公司；吐温20 购自北京鼎国生物技术有限公司；Nisin标准品为Sigma公司产品。
上海分析仪器厂的752 型分光光度计，BioRAD MicroPulser(25uF，200Ω)电转化仪和 0.2 cm 电转化杯，BioRAD PCR仪，BioRAD 荧光定量PCR仪，Alpha InnotechCorporation凝胶成像分析系统。
1．1．3 引物
实验中所设计引物见表1。
表1 基因克隆
Table1. The primers of gene cloning
Primer
Sequence (5’→3’)
pksCupF
GGATCC CGATATTGCTATTGTCGGTATG
pksCupR
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 2
1 材料与方法 2
1．1 材料 2
1．1．3 引物 3
1．1．4 培养基及试剂配方 3
1．2 方法 3
1．2．1 重组质粒的构建 3
1．2．2 缺失菌株的筛选 4
1．2．3 缺失菌株与野生菌株生长曲线的测定 5
1．2．4 Nisin效价标准曲线的制作及不同菌株发酵上清液效价测定 5
1．2．5 缺失菌株与野生菌株nisZ转录量的测定 6
2 结果与分析 6
2．1 重组质粒构建 6
2．1．1 上下游同源臂融合 6
2．1．2 融合片段与pCS1966连接验证 7
2．2 缺失菌株的构建与验证 7
2．3 缺失菌株与原始菌株生长曲线的比较分析 8
2．4 Nisin效价标准曲线及不同菌株发酵上清液抑菌效果和效价比较 8
2．4．1 L. lactis N8和缺失菌株发酵上清液抑菌效果比较 8
2．4．2 Nisin效价标准曲线及不同菌株发酵上清液抑菌效价比较 9
2．5 缺失菌株与原始菌株nisZ转录水平的比较 10
3 讨论 11
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
/> 致谢 12
参考文献 13
pksC基因的敲除对乳酸乳球菌N8产Nisin的影响
食工111 符雨欣
引言
引言
乳酸菌(Lactic acid bacteria, LAB) 是一类能从可发酵碳水化合物 (主要指葡萄糖) 产生大量乳酸的革兰氏阳性细菌的统称，其特点为革兰氏染色阳性，细胞形态为杆菌或球菌，过氧化氢酶为阳性，消耗葡萄糖 50% 以上产生乳酸，不形成内生孢子，无运动性或很少。其中，对于食品酿造工业来说以链球菌属最为重要，特别是链球菌属中的乳球菌群，是乳制品、植物原料发酵食品中常见的菌，常在食品工业中使用。
许多乳酸菌除产生乳酸、乙酸和双乙酰外，还能产生细菌素。Nisin[1]就是其中一种高度翻译后修饰的细菌素，是由属于 N 血清型的某些乳酸链球菌产生的一种核糖体多肽物质。Nisin 可通过形成穿膜孔道引起胞内小分子物质外泄，从而抑制绝大多数革兰氏阳性菌[23]，其抑菌作用已在食品、药品等方面中得到了广泛的应用[45]。Nisin 的生物合成与调控机制是一个复杂的网络机制，目前研究最为清楚的为 Nisin A 和 Nisin Z[67]，二者唯一的区别是Nisin 第28 位氨基酸不同，分别为组氨酸与天冬酰胺。负责 Nisin A、Z 生物合成及调控的基因共有 11 个，nisA/ZBTCIPRKFEG[8]，它们成簇排列在一个约 70 kb 的转座子上，这些基因产物分别负责 Nisin 的翻译后修饰 (NisB 和 NisC)，Nisin 前体的转运 (NisT)，引导肽的剪切 (NisP)，免疫耐受性 (NisI 和 NisF，NisE，NisG)，Nisin 二组分应答调控系统 (NisR 和 NisK) [911]。Nisin 的生物合成过程及其中基因的细胞定位见图1[12]。近几年的研究证明，除 Nisin 生物合成基因簇中的11个基因外，还有很多其他的基因参与其中[13]。
图1 Nisin生物合成
Figure 1. Nisin biosynthesis.
Nisin是一种核糖体肽，即按照mRNA的指令，依靠核糖体将氨基酸合成多肽链。然而非核糖体肽NRPs，它与核糖体肽Nisin的合成存在氨基酸竞争关系。微生物利用NPRs，以非核糖体途径合成天然多肽，这些多肽是一系列低分子量的次级代谢产物，具有生物活性，可被用作抗生素、免疫抑制剂、抗癌和抗病毒因子、铁载体及生物表面活性剂等多肽的装配由NRPs 的多模块酶以硫模板机制完成[14]。
实验室前期研究表明，Nisin的产量与非核糖体肽合成相关基因pksC之间存在一定关系，即nisZ与pksC基因转录水平呈负相关，本实验通过pksC基因（1871bp）的删除，实现非核糖体肽NRPs合成通路的阻断，提高核糖体肽Nisin合成利用氨基酸的效率，从而进一步达到提高Nisin产量的目的。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 菌种及质粒 大肠杆菌 (Escherichia coliDH5α)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactisN8)、藤黄微球菌Micrococcus luteusA1NCIMB86166)、质粒 pCS1966 由本实验室保存。
1．1．2 主要试剂和仪器 实验中所用抗生素购自鼎国科技生物有限公司；限制性内切酶， DNAmarker，反转录试剂盒及PCR荧光定量试剂盒购自Takara公司；M17 肉汤、胰蛋白胨、酵母抽提物购自Oxoid 公司；抗生素 (红霉素)购自上海生工生物技术有限公司；蛋白胨、牛肉粉、琼脂粉购自北京奥星生物技术有限公司；葡萄糖、蔗糖、NaCl 购自天津化学试剂一厂；PCR 产物回收试剂盒，连接酶购自Fermentas公司；质粒快速小提试剂盒，细菌基因组提取试剂盒及RNA快速提取试剂盒购自天根生物科技公司；吐温20 购自北京鼎国生物技术有限公司；Nisin标准品为Sigma公司产品。
上海分析仪器厂的752 型分光光度计，BioRAD MicroPulser(25uF，200Ω)电转化仪和 0.2 cm 电转化杯，BioRAD PCR仪，BioRAD 荧光定量PCR仪，Alpha InnotechCorporation凝胶成像分析系统。
1．1．3 引物
实验中所设计引物见表1。
表1 基因克隆
Table1. The primers of gene cloning
Primer
Sequence (5’→3’)
pksCupF
GGATCC CGATATTGCTATTGTCGGTATG
pksCupR
版权保护: 本文由 hbsrm.com编辑，转载请保留链接: www.hbsrm.com/swgc/spkxygc/398.html
