fabp荧光量子点技术在急性心肌梗死早期诊断中的应用
摘要： 目的 应用量子点免疫层析法，制备检测全血、血浆和血清中心肌型脂肪酸结合蛋白（H-FABP）检测试纸条，用于急性心肌梗死（AMI）早期辅助诊断。 方法 将抗H-FABP单克隆抗体1与羊抗鼠IgG多克隆抗体分别包被于硝酸纤维素膜的检测线（Test Line）和质控线（Control Line），用量子点标记抗H-FABP单克隆抗体2，均匀涂被于玻璃纤维膜上制成量子点结合物垫，组装成试纸条后分别进行精密性、特异性、灵敏性、稳定性及临床样品检测。 结果 该检测卡的检测灵敏度为1ng/ml，15min判定结果,诊断参考值为10ng/ml。 结论 量子点标记的H-FABP检测试纸条有良好的特异性、灵敏性，可用于早期AMI辅助诊断。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1材料 2
1.1.1 试剂、活性材料和耗材2
1.1.1.1 试剂 2
1.1.1.2 活性材料 2
1.1.1.3 耗材3
1.1.2 主要仪器设备3
1.2 实验方法3
1.2.1 量子点介绍 3
1.2.2 量子点浓度与最佳标记浓度 3
1.2.2.1 量子点的标记原理 3
1.2.2.2 量子点浓度3
1.2.2.3 量子点最佳标记浓度3
1.2.3 量子点标记物的制备4
1.2.4 硝酸纤维素膜的包被4 1.2.4.1 包被缓冲液的确定4
1.2.4.2 抗体包被量的确定4
1.2.5 过滤垫处理 4 1.2.6 量子点标记物垫处理4
1.2.7 样品垫处理4
1.2.8 HFABP快速检测试纸条的组装4
1.2.9 HFABP校准品制备5
1.2.10 HFABP 检测试纸条性能验证5
1.2.10.1 特异性5
1.2.10.2 灵敏度5
1.2.10.3
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
线性范围5
1.2.10.4 稳定性5
1.2.10.5精密性5
1.2.11临床样本检测5
1.2.11.1 体检样本检测确定参考值5
1.2.11.2 AMI样本检测5
2 结果与分析6
2.1 硝酸纤维素膜的包被 6
2.1.1 包被缓冲液的确定 6
2.1.2 蛋白包被量的确定6 2.2 HFABP快速检测试纸条的组装 6
2.3 HFABP检测试纸条性能验证 6
2.3.1 特异性6
2.3.2 灵敏度7
2.3.3 线性范围7
2.3.4 稳定性8
2.3.5 精密性8
2.4 临床样本检测 9
2.4.1 体检样本检测确定参考值9
2.4.2 AMI样本检测结果 9
3 讨论9
3.1 量子点免疫层析快速诊断试纸条的展望 10
3.2 定量检测 10
3.3 试剂盒的使用注意事项 10
致谢11
参考文献11
图13
图26
图37
图47
图58
表17
表28
表38
表49
表59
FABP荧光量子点技术在急性心肌梗死早期诊断中的应用
引言
引言：急性心肌梗塞是常见的心血管内科疾病，严重危害着人类的健康，死亡率为10%~15%，近年来发病率逐年增加，有向青年人转移的趋势[1]。急性心肌梗死( Acute Myocardial Infarction, AMI)是冠状动脉急性闭塞，导致冠状动脉血流中断，心肌细胞长时间处于持续缺血缺氧状态，从而导致局部心肌急性坏死。急性心肌梗死起病急，病程危险，预后极差，在世界范围内其发病率和死亡率居高不下，严重威胁着人类的健康与生命[3]。
世界卫生组织推荐的心肌损伤生化标志物诊断标准包括三个方面：病史与症状、心电图表现和生化标志物[2]。国际临床化学联合会(International federation of clinical chemistry, IFCC)的心肌损伤标志物标准化委员会指出：心肌损伤理想的标志物(MI Marker)应是：①在心肌损伤后迅速释放；②在心肌中以高浓度出现，在其他组织中不出现，或在病理情况下只以微量出现；③在血浆中可持续几个小时，以提供常规诊断的时间窗口；④其释放量与心肌损伤的范围直接呈比例[4]。
心肌型脂肪酸结合蛋白（HFABP）是一种可溶性细胞质蛋白，由132个氨基酸组成，分子量为15KD，特异地大量存在于心肌组织中，约占心脏全部可溶性蛋白的4~8%。HFABP是一种新的心肌损伤标志物，正常人的尿和血浆中不含有HFABP，或含量甚少[5,6]。近年来研究发现，心肌型脂肪酸结合蛋白在AMI发生1.5h后出现在血浆中，6h后达到高峰，随后逐渐下降，到24h后恢复到正常水平[6]。而且，HFABP 对早期 AMI的诊断敏感性显著高于CKMB(肌酸激酶同工酶)、 cTnI( 肌钙蛋白I) ，其诊断发病3h 内明显优于CKMB（肌酸激酶同工酶）和MYO（肌红蛋白），表明 HFABP更适合作为早期急性心肌梗死的检测指标[710]。
研究制备HFABP检测试剂盒，为急性心肌梗死的诊断提供一种快速简便的方法，有更良好的临床应用价值。
免疫量子点技术是以量子点作为示踪标志物，应用于抗原抗体反应中的一种新型免疫标记技术[11]。免疫量子点技术更快速、简便，并且灵敏度高，更有利于临床上对HFABP进行早期检测，可以实现即时检验（POCT，pointofcare testing）检测，缩短病人的就医时间，让真正需要治疗的急性心肌梗死病人及时得到治疗，另一方面更可以缩减社会的医疗成本，让那些无需进一步治疗的病人减少支出，释放社会不必要的医疗占用，使医院能救治更多的病人。而且中国的POCT市场现在还是尚未被满足需求的巨大蓝海市场，国内企业的进口替代才刚刚开始。
本课题是在量子点平台上，应用双抗体夹心方法开发定量检测HFABP的试剂盒。反应原理如下：该检测试剂应用量子点免疫层析技术建立的检测体系，采用双抗体夹心法检测人血液样本中的HFABP含量。待检样本加至加样端后，样本通过毛细作用向上扩散，通过结合物垫时样本中的HFABP抗原与量子点标记HFABP抗体结合为量子点标记抗体抗原的复合物；继续扩散至到硝酸纤维素膜上，被包被有HFABP抗体的区域（检测线，T线）拦截，形成量子点标记抗体抗原包被抗体的免疫复合物，这时在检测区产生较高的荧光强度，样本中HFABP含量越高，检测线在紫外灯光下的显色程度越深；量子点标记物继续沿着膜前移，当移至质控线（C线）区域时，质控线显色。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1材料 2
1.1.1 试剂、活性材料和耗材2
1.1.1.1 试剂 2
1.1.1.2 活性材料 2
1.1.1.3 耗材3
1.1.2 主要仪器设备3
1.2 实验方法3
1.2.1 量子点介绍 3
1.2.2 量子点浓度与最佳标记浓度 3
1.2.2.1 量子点的标记原理 3
1.2.2.2 量子点浓度3
1.2.2.3 量子点最佳标记浓度3
1.2.3 量子点标记物的制备4
1.2.4 硝酸纤维素膜的包被4 1.2.4.1 包被缓冲液的确定4
1.2.4.2 抗体包被量的确定4
1.2.5 过滤垫处理 4 1.2.6 量子点标记物垫处理4
1.2.7 样品垫处理4
1.2.8 HFABP快速检测试纸条的组装4
1.2.9 HFABP校准品制备5
1.2.10 HFABP 检测试纸条性能验证5
1.2.10.1 特异性5
1.2.10.2 灵敏度5
1.2.10.3
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
线性范围5
1.2.10.4 稳定性5
1.2.10.5精密性5
1.2.11临床样本检测5
1.2.11.1 体检样本检测确定参考值5
1.2.11.2 AMI样本检测5
2 结果与分析6
2.1 硝酸纤维素膜的包被 6
2.1.1 包被缓冲液的确定 6
2.1.2 蛋白包被量的确定6 2.2 HFABP快速检测试纸条的组装 6
2.3 HFABP检测试纸条性能验证 6
2.3.1 特异性6
2.3.2 灵敏度7
2.3.3 线性范围7
2.3.4 稳定性8
2.3.5 精密性8
2.4 临床样本检测 9
2.4.1 体检样本检测确定参考值9
2.4.2 AMI样本检测结果 9
3 讨论9
3.1 量子点免疫层析快速诊断试纸条的展望 10
3.2 定量检测 10
3.3 试剂盒的使用注意事项 10
致谢11
参考文献11
图13
图26
图37
图47
图58
表17
表28
表38
表49
表59
FABP荧光量子点技术在急性心肌梗死早期诊断中的应用
引言
引言：急性心肌梗塞是常见的心血管内科疾病，严重危害着人类的健康，死亡率为10%~15%，近年来发病率逐年增加，有向青年人转移的趋势[1]。急性心肌梗死( Acute Myocardial Infarction, AMI)是冠状动脉急性闭塞，导致冠状动脉血流中断，心肌细胞长时间处于持续缺血缺氧状态，从而导致局部心肌急性坏死。急性心肌梗死起病急，病程危险，预后极差，在世界范围内其发病率和死亡率居高不下，严重威胁着人类的健康与生命[3]。
世界卫生组织推荐的心肌损伤生化标志物诊断标准包括三个方面：病史与症状、心电图表现和生化标志物[2]。国际临床化学联合会(International federation of clinical chemistry, IFCC)的心肌损伤标志物标准化委员会指出：心肌损伤理想的标志物(MI Marker)应是：①在心肌损伤后迅速释放；②在心肌中以高浓度出现，在其他组织中不出现，或在病理情况下只以微量出现；③在血浆中可持续几个小时，以提供常规诊断的时间窗口；④其释放量与心肌损伤的范围直接呈比例[4]。
心肌型脂肪酸结合蛋白（HFABP）是一种可溶性细胞质蛋白，由132个氨基酸组成，分子量为15KD，特异地大量存在于心肌组织中，约占心脏全部可溶性蛋白的4~8%。HFABP是一种新的心肌损伤标志物，正常人的尿和血浆中不含有HFABP，或含量甚少[5,6]。近年来研究发现，心肌型脂肪酸结合蛋白在AMI发生1.5h后出现在血浆中，6h后达到高峰，随后逐渐下降，到24h后恢复到正常水平[6]。而且，HFABP 对早期 AMI的诊断敏感性显著高于CKMB(肌酸激酶同工酶)、 cTnI( 肌钙蛋白I) ，其诊断发病3h 内明显优于CKMB（肌酸激酶同工酶）和MYO（肌红蛋白），表明 HFABP更适合作为早期急性心肌梗死的检测指标[710]。
研究制备HFABP检测试剂盒，为急性心肌梗死的诊断提供一种快速简便的方法，有更良好的临床应用价值。
免疫量子点技术是以量子点作为示踪标志物，应用于抗原抗体反应中的一种新型免疫标记技术[11]。免疫量子点技术更快速、简便，并且灵敏度高，更有利于临床上对HFABP进行早期检测，可以实现即时检验（POCT，pointofcare testing）检测，缩短病人的就医时间，让真正需要治疗的急性心肌梗死病人及时得到治疗，另一方面更可以缩减社会的医疗成本，让那些无需进一步治疗的病人减少支出，释放社会不必要的医疗占用，使医院能救治更多的病人。而且中国的POCT市场现在还是尚未被满足需求的巨大蓝海市场，国内企业的进口替代才刚刚开始。
本课题是在量子点平台上，应用双抗体夹心方法开发定量检测HFABP的试剂盒。反应原理如下：该检测试剂应用量子点免疫层析技术建立的检测体系，采用双抗体夹心法检测人血液样本中的HFABP含量。待检样本加至加样端后，样本通过毛细作用向上扩散，通过结合物垫时样本中的HFABP抗原与量子点标记HFABP抗体结合为量子点标记抗体抗原的复合物；继续扩散至到硝酸纤维素膜上，被包被有HFABP抗体的区域（检测线，T线）拦截，形成量子点标记抗体抗原包被抗体的免疫复合物，这时在检测区产生较高的荧光强度，样本中HFABP含量越高，检测线在紫外灯光下的显色程度越深；量子点标记物继续沿着膜前移，当移至质控线（C线）区域时，质控线显色。
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