发酵香肠中乳酸菌的分离鉴定
摘要：我国有着丰富的发酵香肠种类和资源，而作为有着丰富的乳酸菌资源的发酵香肠，可以说我国的自然发酵香肠中存在着优良的菌种资源，这些菌种特别适合肉品发酵，尤其是乳杆菌，是最早也是最常用的发酵香肠微生物发酵剂，本实验中，我们选取了5种来自不同产地的发酵香肠，从中分离乳酸菌单菌落，并提取纯菌DNA，利用普通PCR进行鉴定。结果成功的鉴定出20株乳酸菌，主要为发酵乳杆菌、植物乳杆菌、屎肠球菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌。为进一步研究发酵香肠中乳酸菌菌种特性和功能提供了基础。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
绪论 3
1 实验材料与方法4
1.1材料与试剂 4
1.1.1 实验材料
1.1.2主要试剂与培养基
1.2 仪器设备4
1.3实验方案4
1.3.1发酵香肠中乳酸菌的分离4
1.3.2革兰氏染色及镜检方法4
1.3.3乳酸菌DNA的提取5
1.3.4乳酸菌的鉴定6
2 结果与分析6
2.1 16s rRNA 基因测序鉴定及对比结果5
3 实验讨论9
致谢9
参考文献10
图1发酵香肠中分离出的5种乳酸菌菌落形态照片7
图2 革兰氏染色镜检下的细菌形态8
表1从发酵香肠中分离鉴定得到的20株乳酸菌鉴定比对结果及其菌落形态6
附录 菌种测序结果11
发酵香肠中乳酸菌的分离鉴定
引言
发酵香肠为乳酸菌资源含量丰富的发酵肉制品，具有风味独特、营养丰富且具有较长的保质期等特点，并且各个省份地域等有其地域性特点的不同风味风格和制作方法的发酵香肠。而乳酸菌被广泛地应用在发酵肉制品中，被人们认为是对人体安全GRAS（Generally Recognized As Safe）[1]且有益的微生物。
目前我国发酵工艺已经从发酵产品（发酵香肠，发酵火腿等）当中分离并鉴定出多种乳酸菌，其中，较为常见且我国发酵工艺较为常用的有：乳杆菌（植物乳杆菌Lactobacillu
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
s plantarum、戊糖乳杆菌Lactobacillus pentosus、干酪乳杆菌Lactobacillus casei、短乳杆菌Lactobacillus brevis、弯曲乳杆菌Lactobacillus curvatus、清酒乳杆菌Lactobacillus sakei等等）[2][3][4]，肠球菌（粪肠球菌Enterococcus faecalis、屎肠球菌Enterococcus faecium、耐久肠球菌Enterococcus durans）、乳球菌（乳酸乳球菌Lactococcus lactis，格式乳球菌Lactococcus garvieae等）[5][6]、片球菌（乳酸小球菌Pediococcus acidilatici、戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus等）[7]、魏斯氏菌（食窦魏斯氏菌Weissella cibaria、融合魏斯氏菌Weissella confusa、混淆魏斯氏菌Weissella paramesenteroides）[8][9]等等，这些菌种的不同特性和对人体的不同功能也在逐渐的被我们研究和开发。
本实验选取了来自欧洲北部的1种和国内常见的4种发酵香肠，对他们进行乳酸菌的分离提取和鉴定，从而通过结果观察不同地区分离出的不同的乳酸菌种类的多少。
1 实验材料与方法
1．1 材料与试剂
1．1．1 实验材料
南通发酵香肠，河北自制发酵香肠，苏氏发酵香肠（产地非南通），雨润欧洲进口披萨发酵香肠（产地北欧），重庆自制发酵香肠
1．1．2 主要试剂和培养基
生理盐水（225ml均质袋装及4.5mL离心管装）、碳酸钙（上海研生）、溶菌酶（北京索莱宝生物有限公司）、革兰氏染色试剂盒（青岛海博生物科技有限公司）、通用引物27F,1492R、Go Taq Green Master mix（Omega）、TE缓冲液、细菌DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司）。
MRS Agar培养基（90mm规格，培养基厚度约12mm培养皿装）、MRS Broth肉汤（5ml离心管装）
1．2 主要仪器设备
400cc Bag Mixer拍击式均质器：法国Interscience公司
SPX250BZ生化培养箱：上海博讯实业有限公司医疗设备厂
Allegra 64R 高速冷冻离心机：美国Beckman公司
SX500 高压灭菌锅：日本Tomy公司
MB102 金属浴：杭州博日科技有限公司
Veriti 96孔PCR扩增仪：美国Applied Biosystems 公司
Universal Hood II凝胶成像仪：美国BioRad公司
Power Pac HC电泳仪: 美国BioRad公司
1．3 实验方法
1．3．1发酵香肠中乳酸菌的分离
在无菌工作台中，将每一种香肠分装成3个样品，每个样品称取25g，尽量剪碎并放入装有225ml无菌生理盐水的均质袋中，在均质器中以speed 3的速率拍打1min（个别种类的样品肉质不同可稍微延长或缩短拍打时间，速率不变），充分混合均匀，静置数分钟后，取上清液，此上清液即为稀释度为101的样品液，继续将样品浓度稀释至102，103，104，105（5ml离心管装生理盐水）。
取上清液1ml（102、103、104 、105样品稀释液），均匀涂布到MRS Agar培养基上，置于37℃恒温培养箱中培养48 h。
48h之后，首先选择有溶钙圈的菌落（由于乳酸菌在培养过程中会产生乳酸，从而将周围环境中的不溶性碳酸钙溶解成乳酸钙，从而形成透明圈，所以有溶钙圈的菌落为乳酸菌菌落的概率较大），用接种环将选出的菌落挑出，接种至MRS Agar培养基上进行分离纯化。3次分离纯化后，挑单菌落保存在MRS Broth肉汤培养基中（5ml离心管装）在37℃恒温培养箱中培养18到20小时后，提取1ml菌液与1ml甘油混合放于2ml冻存管中于20℃冰柜中保存。
1. 3. 2 革兰氏染色及镜检方法
（1）涂片：取灭过菌的载玻片于实验台上，用移液枪吸取10ul待检样品滴在载玻片的中央，用烧红冷却后的接种环将液滴涂布成一均匀的薄层，涂布面不要过大。
（2）干燥：将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯上高处微微加热直至使水分蒸发。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
绪论 3
1 实验材料与方法4
1.1材料与试剂 4
1.1.1 实验材料
1.1.2主要试剂与培养基
1.2 仪器设备4
1.3实验方案4
1.3.1发酵香肠中乳酸菌的分离4
1.3.2革兰氏染色及镜检方法4
1.3.3乳酸菌DNA的提取5
1.3.4乳酸菌的鉴定6
2 结果与分析6
2.1 16s rRNA 基因测序鉴定及对比结果5
3 实验讨论9
致谢9
参考文献10
图1发酵香肠中分离出的5种乳酸菌菌落形态照片7
图2 革兰氏染色镜检下的细菌形态8
表1从发酵香肠中分离鉴定得到的20株乳酸菌鉴定比对结果及其菌落形态6
附录 菌种测序结果11
发酵香肠中乳酸菌的分离鉴定
引言
发酵香肠为乳酸菌资源含量丰富的发酵肉制品，具有风味独特、营养丰富且具有较长的保质期等特点，并且各个省份地域等有其地域性特点的不同风味风格和制作方法的发酵香肠。而乳酸菌被广泛地应用在发酵肉制品中，被人们认为是对人体安全GRAS（Generally Recognized As Safe）[1]且有益的微生物。
目前我国发酵工艺已经从发酵产品（发酵香肠，发酵火腿等）当中分离并鉴定出多种乳酸菌，其中，较为常见且我国发酵工艺较为常用的有：乳杆菌（植物乳杆菌Lactobacillu
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
s plantarum、戊糖乳杆菌Lactobacillus pentosus、干酪乳杆菌Lactobacillus casei、短乳杆菌Lactobacillus brevis、弯曲乳杆菌Lactobacillus curvatus、清酒乳杆菌Lactobacillus sakei等等）[2][3][4]，肠球菌（粪肠球菌Enterococcus faecalis、屎肠球菌Enterococcus faecium、耐久肠球菌Enterococcus durans）、乳球菌（乳酸乳球菌Lactococcus lactis，格式乳球菌Lactococcus garvieae等）[5][6]、片球菌（乳酸小球菌Pediococcus acidilatici、戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus等）[7]、魏斯氏菌（食窦魏斯氏菌Weissella cibaria、融合魏斯氏菌Weissella confusa、混淆魏斯氏菌Weissella paramesenteroides）[8][9]等等，这些菌种的不同特性和对人体的不同功能也在逐渐的被我们研究和开发。
本实验选取了来自欧洲北部的1种和国内常见的4种发酵香肠，对他们进行乳酸菌的分离提取和鉴定，从而通过结果观察不同地区分离出的不同的乳酸菌种类的多少。
1 实验材料与方法
1．1 材料与试剂
1．1．1 实验材料
南通发酵香肠，河北自制发酵香肠，苏氏发酵香肠（产地非南通），雨润欧洲进口披萨发酵香肠（产地北欧），重庆自制发酵香肠
1．1．2 主要试剂和培养基
生理盐水（225ml均质袋装及4.5mL离心管装）、碳酸钙（上海研生）、溶菌酶（北京索莱宝生物有限公司）、革兰氏染色试剂盒（青岛海博生物科技有限公司）、通用引物27F,1492R、Go Taq Green Master mix（Omega）、TE缓冲液、细菌DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司）。
MRS Agar培养基（90mm规格，培养基厚度约12mm培养皿装）、MRS Broth肉汤（5ml离心管装）
1．2 主要仪器设备
400cc Bag Mixer拍击式均质器：法国Interscience公司
SPX250BZ生化培养箱：上海博讯实业有限公司医疗设备厂
Allegra 64R 高速冷冻离心机：美国Beckman公司
SX500 高压灭菌锅：日本Tomy公司
MB102 金属浴：杭州博日科技有限公司
Veriti 96孔PCR扩增仪：美国Applied Biosystems 公司
Universal Hood II凝胶成像仪：美国BioRad公司
Power Pac HC电泳仪: 美国BioRad公司
1．3 实验方法
1．3．1发酵香肠中乳酸菌的分离
在无菌工作台中，将每一种香肠分装成3个样品，每个样品称取25g，尽量剪碎并放入装有225ml无菌生理盐水的均质袋中，在均质器中以speed 3的速率拍打1min（个别种类的样品肉质不同可稍微延长或缩短拍打时间，速率不变），充分混合均匀，静置数分钟后，取上清液，此上清液即为稀释度为101的样品液，继续将样品浓度稀释至102，103，104，105（5ml离心管装生理盐水）。
取上清液1ml（102、103、104 、105样品稀释液），均匀涂布到MRS Agar培养基上，置于37℃恒温培养箱中培养48 h。
48h之后，首先选择有溶钙圈的菌落（由于乳酸菌在培养过程中会产生乳酸，从而将周围环境中的不溶性碳酸钙溶解成乳酸钙，从而形成透明圈，所以有溶钙圈的菌落为乳酸菌菌落的概率较大），用接种环将选出的菌落挑出，接种至MRS Agar培养基上进行分离纯化。3次分离纯化后，挑单菌落保存在MRS Broth肉汤培养基中（5ml离心管装）在37℃恒温培养箱中培养18到20小时后，提取1ml菌液与1ml甘油混合放于2ml冻存管中于20℃冰柜中保存。
1. 3. 2 革兰氏染色及镜检方法
（1）涂片：取灭过菌的载玻片于实验台上，用移液枪吸取10ul待检样品滴在载玻片的中央，用烧红冷却后的接种环将液滴涂布成一均匀的薄层，涂布面不要过大。
（2）干燥：将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯上高处微微加热直至使水分蒸发。
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