鸡蛋膜蛋白多肽的制备及其抗氧化活性研究
鸡蛋膜是禽蛋的副产物，其主要成分为蛋白质，是一种营养丰富的优质蛋白。鸡蛋膜蛋白经水解成肽后，具有很强的抗氧化性，可以有效的抑制膜脂质过氧化，是一种具有开发潜力的抗氧化肽来源，可以应用到食品及化妆品等多个领域。本课题将鸡蛋膜蛋白水解物通过高速离心，收集超滤液后，测其抗氧化活性，发现上清液具有很好的抗氧化活性，将其冻干备用。通过葡聚糖凝胶Sephadex G-25进行层析分离，通过紫外分光光度计测其吸光值，根据出峰时间分离出不同分子量范围的多肽组分，冻干备用。将分离后的多肽组分通过DPPH法、ABTS法、FRAP法对分离后的五个多肽组分进行抗氧化活性研究，其中ESP-3清除DPPH自由基的活性最好，ESP-2清除ABTS自由基和还原铁离子的活性最佳，ESP-2和ESP-3的细胞抗氧化活性最佳。
目录
摘要 3
关键词 3
Abstract 3
Key words 4
引言 4
1 材料与方法 5
1.1 试验材料 5
1．1.1 材料与试剂 5
1．1.2 仪器设备 5
1．2 试验方法 6
1.2.1 鸡蛋壳膜蛋白水解物的制备 6
1.2.2 鸡蛋壳膜蛋白多肽的超滤 6
1.2.3 Sephadex G25 分离纯化鸡蛋壳膜蛋白多肽 6
1.2.4 多肽组分分子量的测定 6
1.2.5 多肽组分蛋白含量的测定 6
1.2.6 鸡蛋壳膜蛋白多肽 DPPH 自由基清除能力测定 7
1.2.7 鸡蛋壳膜蛋白多肽 ABTS自由基清除能力测定 7
1.2.8 鸡蛋壳膜蛋白多肽 FRAP自由基清除能力测定 7
1.2.9 鸡蛋壳膜蛋白多肽细胞抗氧化活性测定 7
2 结果与分析 8
2.1 超滤组分 DPPH 自由基清除能力测定 8
2.2 超滤组分 ABTS自由基清除能力测定 9
2.3 超滤组分铁离子还原力测定 10
2.4 Sephadex G25 柱对鸡蛋壳膜蛋白多肽的分离效果 11
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
2.5 蛋白含量测定 11
2.6 鸡蛋壳膜蛋白多肽层析组分 DPPH 自由基清除能力测定 12
2.7 鸡蛋壳膜蛋白多肽层析组分 ABTS自由基清除能力测定 12
2.8 鸡蛋壳膜蛋白多肽层析组分铁离子还原力测定 13
2.9 鸡蛋壳膜蛋白多肽细胞抗氧化活性测定 13
3 讨论 13
致谢 14
参考文献： 14
鸡蛋膜蛋白多肽的制备及其抗氧化活性研究
引言
引言
我国既是养禽大国，也是禽蛋生产大国，近二十年来，我国的禽蛋产量一直稳居全球前列。从来源广且廉价的蛋壳中提取蛋白不仅可以解决环境污染，还可以拓宽蛋白提取的来源，带来巨大的经济效益[1]。在当今处于可持续发展和注重环保的社会环境下，产量丰富的鸡蛋膜蛋白作为一种高营养的优质蛋白，正日益受到关注并成为研究热点。目前看来，我国这块研究方面还欠缺成熟的分离技术，需要进一步研发利用，变废为宝，将可持续发展道路坚持到底[2]。鸡蛋膜蛋白经水解成多肽后，具有很强的抗氧化性，有效抑制膜脂质过氧化，可应用到食品及化妆品等其它领域。
到目前为止，对鸡蛋膜的应用包括吸附重金属离子、烧伤的生物敷料、酶固定化和细胞培养基质等[3]。熊曦[4]等报道了一种从天然鸡蛋壳膜中提取可溶性鸡蛋壳膜蛋白的方法，该方法通过β硫代丙酸/乙酸的还原溶解以及碱中和，得到了一种白色粉状产品，产率较高，分离得到的膜蛋白不溶于水，可以溶于酸性和碱性水溶液及六氟异丙醇等有机溶剂，扩大了应用。周艳华[5]采用二次提取法提取可溶性鸡蛋壳膜蛋白，通过单因素和正交试验对结果进行优化。结果表明二次采用胃蛋白酶提取可使鸡蛋壳膜蛋白的提取率高达75.82%，而通过二次反应可使鸡蛋壳膜蛋白的提取率高达93.62%，基本达到了全蛋壳膜利用的目的。多肽的制备方法很多，总体来讲有以下几种：a.提取法，即从富含肽的生物机体内通过不同的工艺将其提取出来，可采用盐析、层析、沉淀等物理方法，分离纯化出以天然形式存在的活性多肽。由于此方法的原料来源、种类有限，因此限制了提取法的应用范围；b.化学合成法，即把氨基酸附着在载体上，然后从氨基端或羧基端逐步增长肽链来合成所需的多肽；c.化学水解法，即以天然蛋白质为原料，经酸水解或碱水解得到多肽[6]。张娴[7]通过研究鸡蛋膜蛋白酶解法工艺条件发现，固液比对水解度和肽含量基本无太大影响，影响较大的为反应时间、反应温度、溶液和酶用量这四个因素。周艳华[8]在四个不同的化学发光体系中测定了鸡蛋壳膜蛋白及其酶解液清除超氧阴离子、羟基自由基、双氧水和对损伤的保护作用的抗氧化活性，结果表明碱性蛋白酶酶解液具有较强的抗氧化活性。杨德玉[9]等以鸡蛋蛋壳膜为原料，采用酶法提取了鸡蛋壳膜中的角蛋白，并得到了其提取的最佳工艺条件，角蛋白提取率可达26%，但并没有对此酶解液进行鉴定和相关研究。周艳华[11]等采用凝胶排阻层析将碱性蛋白酶酶解液分离出三个组分SP1、SP2、SP3，采用化学分光法测定发现SP2组分具有较强的抗氧化活性，其平均分子量为618.86 Da，所占比例为68.15%。史雅凝[12]研究发现鸡蛋膜蛋白酶解物具有抗氧化应激和抗炎活性，可以有效保护肠道健康。该研究为探寻提高鸡蛋膜附加值的方法提供新的思路，同时为研发具有生物活性的可食性鸡蛋膜蛋白食品提供理论依据。
超滤透过通量的影响因素主要有操作压力、料液温度、运行周期、物料浓度等。虽然影响超滤的因素很多，但是超滤膜法具有传统分离操作(如蒸发、萃取)等无可比拟的优点，如无相变、效率高、操作简便、能耗低、工艺设备简单、以及分离效果好，同时不会造成环境污染等，故在食品等行业中应用越来越广泛。本实验采用超滤技术分离鸡蛋壳膜蛋白多肽粗品，进一步对多肽分离纯化，以备后期试验。
凝胶过滤色谱，也叫凝胶色谱分子筛法，是利用凝胶网状结构，根据分子大小和形状差异进行分离的一种方法。当样品进入凝胶柱后，较大分子不能通过孔道进入凝胶柱体内，而与流动相一起流出层析柱，而小分子则渗入凝胶内。它具有分离条件温和，产品收率高，生物活性好，分离面宽等优点。由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果，目前，己经被生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域广泛采用。凝胶过滤色谱的介质的分离范围一般是以水溶性蛋白来确定较适合用于蛋白质酶解物的粗分离，一般有常压凝胶色谱和高压凝胶过滤色谱，常压凝胶过滤色谱常用的葡聚糖凝胶一般有Sephadex G15、Sephadex G25或丙烯酞胺凝胶Biogel P2、Biogel P4、Biogel P6等。
目录
摘要 3
关键词 3
Abstract 3
Key words 4
引言 4
1 材料与方法 5
1.1 试验材料 5
1．1.1 材料与试剂 5
1．1.2 仪器设备 5
1．2 试验方法 6
1.2.1 鸡蛋壳膜蛋白水解物的制备 6
1.2.2 鸡蛋壳膜蛋白多肽的超滤 6
1.2.3 Sephadex G25 分离纯化鸡蛋壳膜蛋白多肽 6
1.2.4 多肽组分分子量的测定 6
1.2.5 多肽组分蛋白含量的测定 6
1.2.6 鸡蛋壳膜蛋白多肽 DPPH 自由基清除能力测定 7
1.2.7 鸡蛋壳膜蛋白多肽 ABTS自由基清除能力测定 7
1.2.8 鸡蛋壳膜蛋白多肽 FRAP自由基清除能力测定 7
1.2.9 鸡蛋壳膜蛋白多肽细胞抗氧化活性测定 7
2 结果与分析 8
2.1 超滤组分 DPPH 自由基清除能力测定 8
2.2 超滤组分 ABTS自由基清除能力测定 9
2.3 超滤组分铁离子还原力测定 10
2.4 Sephadex G25 柱对鸡蛋壳膜蛋白多肽的分离效果 11
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2.5 蛋白含量测定 11
2.6 鸡蛋壳膜蛋白多肽层析组分 DPPH 自由基清除能力测定 12
2.7 鸡蛋壳膜蛋白多肽层析组分 ABTS自由基清除能力测定 12
2.8 鸡蛋壳膜蛋白多肽层析组分铁离子还原力测定 13
2.9 鸡蛋壳膜蛋白多肽细胞抗氧化活性测定 13
3 讨论 13
致谢 14
参考文献： 14
鸡蛋膜蛋白多肽的制备及其抗氧化活性研究
引言
引言
我国既是养禽大国，也是禽蛋生产大国，近二十年来，我国的禽蛋产量一直稳居全球前列。从来源广且廉价的蛋壳中提取蛋白不仅可以解决环境污染，还可以拓宽蛋白提取的来源，带来巨大的经济效益[1]。在当今处于可持续发展和注重环保的社会环境下，产量丰富的鸡蛋膜蛋白作为一种高营养的优质蛋白，正日益受到关注并成为研究热点。目前看来，我国这块研究方面还欠缺成熟的分离技术，需要进一步研发利用，变废为宝，将可持续发展道路坚持到底[2]。鸡蛋膜蛋白经水解成多肽后，具有很强的抗氧化性，有效抑制膜脂质过氧化，可应用到食品及化妆品等其它领域。
到目前为止，对鸡蛋膜的应用包括吸附重金属离子、烧伤的生物敷料、酶固定化和细胞培养基质等[3]。熊曦[4]等报道了一种从天然鸡蛋壳膜中提取可溶性鸡蛋壳膜蛋白的方法，该方法通过β硫代丙酸/乙酸的还原溶解以及碱中和，得到了一种白色粉状产品，产率较高，分离得到的膜蛋白不溶于水，可以溶于酸性和碱性水溶液及六氟异丙醇等有机溶剂，扩大了应用。周艳华[5]采用二次提取法提取可溶性鸡蛋壳膜蛋白，通过单因素和正交试验对结果进行优化。结果表明二次采用胃蛋白酶提取可使鸡蛋壳膜蛋白的提取率高达75.82%，而通过二次反应可使鸡蛋壳膜蛋白的提取率高达93.62%，基本达到了全蛋壳膜利用的目的。多肽的制备方法很多，总体来讲有以下几种：a.提取法，即从富含肽的生物机体内通过不同的工艺将其提取出来，可采用盐析、层析、沉淀等物理方法，分离纯化出以天然形式存在的活性多肽。由于此方法的原料来源、种类有限，因此限制了提取法的应用范围；b.化学合成法，即把氨基酸附着在载体上，然后从氨基端或羧基端逐步增长肽链来合成所需的多肽；c.化学水解法，即以天然蛋白质为原料，经酸水解或碱水解得到多肽[6]。张娴[7]通过研究鸡蛋膜蛋白酶解法工艺条件发现，固液比对水解度和肽含量基本无太大影响，影响较大的为反应时间、反应温度、溶液和酶用量这四个因素。周艳华[8]在四个不同的化学发光体系中测定了鸡蛋壳膜蛋白及其酶解液清除超氧阴离子、羟基自由基、双氧水和对损伤的保护作用的抗氧化活性，结果表明碱性蛋白酶酶解液具有较强的抗氧化活性。杨德玉[9]等以鸡蛋蛋壳膜为原料，采用酶法提取了鸡蛋壳膜中的角蛋白，并得到了其提取的最佳工艺条件，角蛋白提取率可达26%，但并没有对此酶解液进行鉴定和相关研究。周艳华[11]等采用凝胶排阻层析将碱性蛋白酶酶解液分离出三个组分SP1、SP2、SP3，采用化学分光法测定发现SP2组分具有较强的抗氧化活性，其平均分子量为618.86 Da，所占比例为68.15%。史雅凝[12]研究发现鸡蛋膜蛋白酶解物具有抗氧化应激和抗炎活性，可以有效保护肠道健康。该研究为探寻提高鸡蛋膜附加值的方法提供新的思路，同时为研发具有生物活性的可食性鸡蛋膜蛋白食品提供理论依据。
超滤透过通量的影响因素主要有操作压力、料液温度、运行周期、物料浓度等。虽然影响超滤的因素很多，但是超滤膜法具有传统分离操作(如蒸发、萃取)等无可比拟的优点，如无相变、效率高、操作简便、能耗低、工艺设备简单、以及分离效果好，同时不会造成环境污染等，故在食品等行业中应用越来越广泛。本实验采用超滤技术分离鸡蛋壳膜蛋白多肽粗品，进一步对多肽分离纯化，以备后期试验。
凝胶过滤色谱，也叫凝胶色谱分子筛法，是利用凝胶网状结构，根据分子大小和形状差异进行分离的一种方法。当样品进入凝胶柱后，较大分子不能通过孔道进入凝胶柱体内，而与流动相一起流出层析柱，而小分子则渗入凝胶内。它具有分离条件温和，产品收率高，生物活性好，分离面宽等优点。由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果，目前，己经被生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域广泛采用。凝胶过滤色谱的介质的分离范围一般是以水溶性蛋白来确定较适合用于蛋白质酶解物的粗分离，一般有常压凝胶色谱和高压凝胶过滤色谱，常压凝胶过滤色谱常用的葡聚糖凝胶一般有Sephadex G15、Sephadex G25或丙烯酞胺凝胶Biogel P2、Biogel P4、Biogel P6等。
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