海蚬多糖磷酸化研究
目 录
1 引言1
1.1 海蚬多糖的特性及营养价值1
1.2 海蚬多糖磷酸化的发展现状前景2
1.3 本课问题题研究的目的和意义3
2 实验材料和方法4
2.1 实验材料4
2.2 研究方法5
2.3 实验设计7
2.4 磷酸化正交实验设计8
2.5 鉴定指标8
3 结果与分析9
3.1 多糖的提取9
3.2 单因素对于磷酸化多糖的影响9
3.3 正交实验结果与分析11
3.4 红外光谱分析12
3.5 抗氧化测定12
结论 14
致谢 15参考文献16
1 2 引言
海蚬，即环纹蛤，贝类动物。贝壳近圆形，壳面极凸出，生长纹明显贝壳内边缘具整齐的小齿。贝壳中型属于软体动物，以其强而有力的斧足潜行，平常将水管伸出来交换氧气及吸取食物。3月份后，海蚬摄食活动逐渐增强，因而生长速度较快。海蚬最适生长水温为24℃~30℃。在此范围内温度越高海蚬摄食活动越强，新陈代谢越旺盛。海蚬主要分布于日本及中国大陆，栖息场所为河口或砂泥质的浅水区，栖息水深大约在四至五公尺深[1]。
海蚬是我国重要的经济水产品之一，养丰富，富含碳水化合物、蛋白质、氨基酸、不饱和脂肪酸、微量元素等。海蚬肉经过清洗、破碎等预处理之后，采用热水进行浸提。水提液经过滤、浓缩、干燥等制成海蚬水浸提物。较多研究证实，海蚬水浸提物具有抗肿瘤、增强免疫力等生理功能。海蚬水浸提物中含有大量活性多糖，活性多糖是一类具有免疫调节等特殊生理功能的多糖，它的来源及其广泛，在动物、植物、微生物体内皆存在。该多糖类化合 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
物具有调节机体免疫力、抗肿瘤、抗氧化、抗凝血、抗心脑血管疾病等多种特殊抗病作用。
多糖可经修饰得到多种多糖衍生物，这些多糖衍生物具有多种作用，如对纤维素进行化学修饰后可获得离子交换纤维素、抗凝血纤维素等许多有特殊功能的纤维素衍生物，多糖衍生物同时还具有抗凝血、抗氧化、抗肿瘤等活性。经化学修饰后的多糖可以增强其生物活性，或产生新的生物活性，有利于多糖类药物的开发与利用。多糖经分子修饰后获得各种结构类型和各种生物活性的多糖衍生物，为多糖结构与功能关系分析奠定了基础，而结构与功能关系研究结果又指导着多糖分子修饰的方向，为多糖类功能性食品的设计、研究和开发提供理论支持。许多实验证明多糖的活性直接或间接地受其分子结构的影响，采取一定的方法，如硫酸化、磷酸化、烷基化、磺酞化等对多糖分子结构进行修饰，可以提高多糖的活性、降低其毒副作用。
1.1 海蚬多糖的特性及营养价值
1.1.1 海蚬多糖的特性
多糖是存在于多种有机物内的生物大分子物质，在动植物以及微生物体内皆存在着。多糖及其复合物在生物体中不仅作为能量资源及构成材料，同时它也存在于一切细胞膜结构中，参与细胞的各种活动，具有多种的生物学功能。
1.1.2 海蚬多糖及其磷酸化的价值
多糖类化合物能作为一种免疫调节剂，能激活免疫细胞，提高机体免疫功能，具有调节机体免疫力、抗肿瘤、抗氧化、抗凝血、抗心脑血管疾病等多种特殊抗病作用。经磷酸化修饰后的多糖衍生物其抗肿瘤、抗凝血和免疫调节等生物活性得到明显提高。
1.1.2.1 抗肿瘤性
多糖进行磷酸化修饰之后出现较强的抗肿瘤活性，将其与硫酸化及羧甲基化衍生物对比，结果显示磷酸化衍生物抗肿瘤活性最好。将多糖进行磷酸化修饰之后发现抗肿瘤活性明显提高。一些研究发现，磷酸化多糖衍生物的肿瘤抑制率可达16.25%，而未经磷酸化的仅有9.41%。这表明磷酸根在多糖抗肿瘤活性方面发挥了重要作用，这可能与磷酸化多糖的免疫激活活性有关，通过激活免疫应答，促进免疫细胞增殖分化，间接起到抗肿瘤效果。
1.1.2.2 免疫调节
多糖类化合物作为一种免疫调节剂，能够激活免疫细胞，提高机体的免疫功能。近年来磷酸化多糖所表现出的免疫调节活性越来越引起人们的关注。有关研究发现从蛋白核小球藻中分离得到的半乳聚糖磷酸酯具有较强的巨噬细胞激活作用；乳酸菌具有免疫激活、抗肿瘤等多种生物活性，这些生物活性主要来自于乳酸菌的胞外磷酸化多糖。合成磷酸化多糖同样也具有免疫调节的活性。钙离子是触发淋巴细胞增殖反应的第一信号，磷酸化多糖具有抑制磷酸钙沉淀形成的能力，这样可以有助于钙离子与钙离子载体A23187结合，促进钙离子细胞内流，激发B细胞和T细胞增殖。
1.1.2.3 多糖及其衍生物的其他价值
磷酸化多糖还具有抗病毒、抗氧化等生物活性。研究发现果聚糖经磷酸化修饰之后抗疱疹病毒的活性明显提高，但具体作用机制仍需进一步探讨。对κ-卡拉胶进行过硫酸化、磷酸化、乙酰化修饰，结果发现相比于过硫酸化及乙酰化卡拉胶，磷酸化卡拉胶具有较好的清除羟基自由基和DPPH的活性[2]。
1.2 海蚬多糖磷酸化的发展现状及前景
1.2.1 多糖磷酸化技术研究现状
目前，无论天然磷酸化多糖还是合成磷酸化多糖，对 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
其生物活性的研究主要集中在免疫调节、抗肿瘤、抗病毒等方面。同时，磷酸化也赋予多糖新的性能，在开发新材料方面极具发展潜力。
虽然对海蚬等海洋生物多糖已展开大量研究，但是进入临床应用的还不多。主要原因是对海洋药用生物资源的开发缺乏系统，也存在资金投入不足的因素。对此，必须强调多学科联合，充分调动海洋生物学、药理学、化学、病毒学等各科力量，形成共识，对发现的海洋活性物质及时进行构效研究，利用人工合成其类似物的方法进行改造和修饰，从而降低化合物毒性，提高药物的选择性。
随着海洋生物活性多糖筛选技术的发展，将会有很多特异、高效和结构新颖多样的活性多糖出现，海洋多糖的作用机制也随着分子生物学技术及其他先进测试技术的发展得到进一步探讨。
1.2.2 海蚬活性多糖的发展趋势
开发新型材料，多糖经磷酸化之后，除具有多种生物活性之外，也赋予其良好的性能，目前研究最为广泛的是磷酸化纤维素、磷酸化壳聚寡糖等。磷酸化纤维素具有微纤结构，可以作为蛋白质吸附剂，有希望用于蛋白质生物制品的电泳分离和提纯；磷酸化壳聚糖具有良好的生物相容性，能作为骨骼替换材料；适用于整形和组织工程；磷酸化壳聚糖凝胶可以作为药物控释材料，用于控制口服给药系统。
天然多糖衍生物一般没有细胞毒性且药物质量通过化学手段容易控制，已成为当今新药的发展方向之一，它们在临床应用中显示出广阔的前景，将越来越多地被用作抗肿瘤、治疗艾滋病等抗病毒药、抗衰老药和降血糖药。可以预见，随着多糖分子修饰方法的完善和技术水平的提高，以及基础医学，临床医学不断深入，运用分子修饰手段将开发出更多抗肿瘤、抗凝血、提高免疫力、抗艾滋病病毒等新型药物及保健品。
小烧杯中用水溶解一定量的磷酸化试剂(三聚磷酸钠与三偏磷酸钠质量比为6:1),溶解后再加入精制的0.01 g/mL海蚬多糖，调pH值后，在一定温度条件下反应一定时间，样液用4倍体积的95% 乙醇沉淀24 h，将醇沉多糖冷冻干燥，再于60℃水浴中复溶，复溶后的溶液于透析袋选用截留相对分子质量为3600的透析袋以蒸馏水为透析液透析2 d，将透析袋内液体浓缩到适量体积后进行冷冻干燥得磷酸化衍生物[3]。
1 引言1
1.1 海蚬多糖的特性及营养价值1
1.2 海蚬多糖磷酸化的发展现状前景2
1.3 本课问题题研究的目的和意义3
2 实验材料和方法4
2.1 实验材料4
2.2 研究方法5
2.3 实验设计7
2.4 磷酸化正交实验设计8
2.5 鉴定指标8
3 结果与分析9
3.1 多糖的提取9
3.2 单因素对于磷酸化多糖的影响9
3.3 正交实验结果与分析11
3.4 红外光谱分析12
3.5 抗氧化测定12
结论 14
致谢 15参考文献16
1 2 引言
海蚬，即环纹蛤，贝类动物。贝壳近圆形，壳面极凸出，生长纹明显贝壳内边缘具整齐的小齿。贝壳中型属于软体动物，以其强而有力的斧足潜行，平常将水管伸出来交换氧气及吸取食物。3月份后，海蚬摄食活动逐渐增强，因而生长速度较快。海蚬最适生长水温为24℃~30℃。在此范围内温度越高海蚬摄食活动越强，新陈代谢越旺盛。海蚬主要分布于日本及中国大陆，栖息场所为河口或砂泥质的浅水区，栖息水深大约在四至五公尺深[1]。
海蚬是我国重要的经济水产品之一，养丰富，富含碳水化合物、蛋白质、氨基酸、不饱和脂肪酸、微量元素等。海蚬肉经过清洗、破碎等预处理之后，采用热水进行浸提。水提液经过滤、浓缩、干燥等制成海蚬水浸提物。较多研究证实，海蚬水浸提物具有抗肿瘤、增强免疫力等生理功能。海蚬水浸提物中含有大量活性多糖，活性多糖是一类具有免疫调节等特殊生理功能的多糖，它的来源及其广泛，在动物、植物、微生物体内皆存在。该多糖类化合 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
物具有调节机体免疫力、抗肿瘤、抗氧化、抗凝血、抗心脑血管疾病等多种特殊抗病作用。
多糖可经修饰得到多种多糖衍生物，这些多糖衍生物具有多种作用，如对纤维素进行化学修饰后可获得离子交换纤维素、抗凝血纤维素等许多有特殊功能的纤维素衍生物，多糖衍生物同时还具有抗凝血、抗氧化、抗肿瘤等活性。经化学修饰后的多糖可以增强其生物活性，或产生新的生物活性，有利于多糖类药物的开发与利用。多糖经分子修饰后获得各种结构类型和各种生物活性的多糖衍生物，为多糖结构与功能关系分析奠定了基础，而结构与功能关系研究结果又指导着多糖分子修饰的方向，为多糖类功能性食品的设计、研究和开发提供理论支持。许多实验证明多糖的活性直接或间接地受其分子结构的影响，采取一定的方法，如硫酸化、磷酸化、烷基化、磺酞化等对多糖分子结构进行修饰，可以提高多糖的活性、降低其毒副作用。
1.1 海蚬多糖的特性及营养价值
1.1.1 海蚬多糖的特性
多糖是存在于多种有机物内的生物大分子物质，在动植物以及微生物体内皆存在着。多糖及其复合物在生物体中不仅作为能量资源及构成材料，同时它也存在于一切细胞膜结构中，参与细胞的各种活动，具有多种的生物学功能。
1.1.2 海蚬多糖及其磷酸化的价值
多糖类化合物能作为一种免疫调节剂，能激活免疫细胞，提高机体免疫功能，具有调节机体免疫力、抗肿瘤、抗氧化、抗凝血、抗心脑血管疾病等多种特殊抗病作用。经磷酸化修饰后的多糖衍生物其抗肿瘤、抗凝血和免疫调节等生物活性得到明显提高。
1.1.2.1 抗肿瘤性
多糖进行磷酸化修饰之后出现较强的抗肿瘤活性，将其与硫酸化及羧甲基化衍生物对比，结果显示磷酸化衍生物抗肿瘤活性最好。将多糖进行磷酸化修饰之后发现抗肿瘤活性明显提高。一些研究发现，磷酸化多糖衍生物的肿瘤抑制率可达16.25%，而未经磷酸化的仅有9.41%。这表明磷酸根在多糖抗肿瘤活性方面发挥了重要作用，这可能与磷酸化多糖的免疫激活活性有关，通过激活免疫应答，促进免疫细胞增殖分化，间接起到抗肿瘤效果。
1.1.2.2 免疫调节
多糖类化合物作为一种免疫调节剂，能够激活免疫细胞，提高机体的免疫功能。近年来磷酸化多糖所表现出的免疫调节活性越来越引起人们的关注。有关研究发现从蛋白核小球藻中分离得到的半乳聚糖磷酸酯具有较强的巨噬细胞激活作用；乳酸菌具有免疫激活、抗肿瘤等多种生物活性，这些生物活性主要来自于乳酸菌的胞外磷酸化多糖。合成磷酸化多糖同样也具有免疫调节的活性。钙离子是触发淋巴细胞增殖反应的第一信号，磷酸化多糖具有抑制磷酸钙沉淀形成的能力，这样可以有助于钙离子与钙离子载体A23187结合，促进钙离子细胞内流，激发B细胞和T细胞增殖。
1.1.2.3 多糖及其衍生物的其他价值
磷酸化多糖还具有抗病毒、抗氧化等生物活性。研究发现果聚糖经磷酸化修饰之后抗疱疹病毒的活性明显提高，但具体作用机制仍需进一步探讨。对κ-卡拉胶进行过硫酸化、磷酸化、乙酰化修饰，结果发现相比于过硫酸化及乙酰化卡拉胶，磷酸化卡拉胶具有较好的清除羟基自由基和DPPH的活性[2]。
1.2 海蚬多糖磷酸化的发展现状及前景
1.2.1 多糖磷酸化技术研究现状
目前，无论天然磷酸化多糖还是合成磷酸化多糖，对 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
其生物活性的研究主要集中在免疫调节、抗肿瘤、抗病毒等方面。同时，磷酸化也赋予多糖新的性能，在开发新材料方面极具发展潜力。
虽然对海蚬等海洋生物多糖已展开大量研究，但是进入临床应用的还不多。主要原因是对海洋药用生物资源的开发缺乏系统，也存在资金投入不足的因素。对此，必须强调多学科联合，充分调动海洋生物学、药理学、化学、病毒学等各科力量，形成共识，对发现的海洋活性物质及时进行构效研究，利用人工合成其类似物的方法进行改造和修饰，从而降低化合物毒性，提高药物的选择性。
随着海洋生物活性多糖筛选技术的发展，将会有很多特异、高效和结构新颖多样的活性多糖出现，海洋多糖的作用机制也随着分子生物学技术及其他先进测试技术的发展得到进一步探讨。
1.2.2 海蚬活性多糖的发展趋势
开发新型材料，多糖经磷酸化之后，除具有多种生物活性之外，也赋予其良好的性能，目前研究最为广泛的是磷酸化纤维素、磷酸化壳聚寡糖等。磷酸化纤维素具有微纤结构，可以作为蛋白质吸附剂，有希望用于蛋白质生物制品的电泳分离和提纯；磷酸化壳聚糖具有良好的生物相容性，能作为骨骼替换材料；适用于整形和组织工程；磷酸化壳聚糖凝胶可以作为药物控释材料，用于控制口服给药系统。
天然多糖衍生物一般没有细胞毒性且药物质量通过化学手段容易控制，已成为当今新药的发展方向之一，它们在临床应用中显示出广阔的前景，将越来越多地被用作抗肿瘤、治疗艾滋病等抗病毒药、抗衰老药和降血糖药。可以预见，随着多糖分子修饰方法的完善和技术水平的提高，以及基础医学，临床医学不断深入，运用分子修饰手段将开发出更多抗肿瘤、抗凝血、提高免疫力、抗艾滋病病毒等新型药物及保健品。
小烧杯中用水溶解一定量的磷酸化试剂(三聚磷酸钠与三偏磷酸钠质量比为6:1),溶解后再加入精制的0.01 g/mL海蚬多糖，调pH值后，在一定温度条件下反应一定时间，样液用4倍体积的95% 乙醇沉淀24 h，将醇沉多糖冷冻干燥，再于60℃水浴中复溶，复溶后的溶液于透析袋选用截留相对分子质量为3600的透析袋以蒸馏水为透析液透析2 d，将透析袋内液体浓缩到适量体积后进行冷冻干燥得磷酸化衍生物[3]。
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