猪胰蛋白酶的提取纯化及性质研究
目 录
1 引言 1
1.1 胰蛋白酶性质 1
1.2 胰蛋白酶的应用 1
1.3 猪胰蛋白酶的提取工艺 3
1.4 本课题研究的目的、意义和内容 3
2 实验用品 3
2.1 实验原料 3
2.2 实验仪器 3
2.3 实验药品 4
3 胰蛋白酶的提取纯化 4
3.1 实验方法 4
3.2 结果与分析 12
4 胰蛋白酶性质的研究 15
4.1 实验方法 15
4.2 结果与分析 13
结 论 19
致 谢 20
参 考 文 献 21
1 引言
胰酶包含有胰蛋白酶、糜蛋白酶、激肽释放酶、羧肽酶、核糖核酸酶等，是常从猪、牛、羊等动物胰脏中获得的多种酶的混合物，经常被作为原料用于医药、工业等行业。在蛋白行业中，胰酶被用于水解大分子蛋白质，得到寡肽、氨基酸等低分子肽类物质。其中胰蛋白酶用途最广泛，用量也最多。但胰酶是多种酶的混合物，因此需要将胰蛋白酶提取并分离纯化。作为一种消化酶、肽链内切酶的胰蛋白酶，在医药、生化等领域发挥着重要的作用，经济价值可观。本实验用猪胰脏粗提的胰酶为研究对象，通过对胰蛋白酶的分离纯化和相关性质研究，建立起一套分离纯化胰蛋白酶的方法，为今后科学研究和工业应用奠定相应的理论和应用基础。
猪胰蛋白酶是一种蛋白质，易变性，因此在整个酶的提取过程中应该避免极端条件，尽可能在比较温和的条件下进行，同时保证在较低的温度下进行操作，以减少酶活的损失。
1.1 胰蛋白酶性质
胰蛋白酶Trypsin(Parenzy *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
me) 是属于蛋白酶的一种，EC3.4.21.4,能在脊椎动物中发挥消化酶的作用。胰蛋白酶作为胰液的成分而分泌，因肠激酶或胰蛋白酶的限制而分解成为活化胰蛋白酶。它是肽链内切酶，能将多肽链中赖氨酸和精氨酸残基中的羧基侧切断[1]。作为特异性最强的蛋白酶，它不但作为消化酶起作用，而且还能限制分解羧肽酶原、糜蛋白酶原、磷脂酶原等其它酶的前体。
胰蛋白酶原的相对分子量约为24 kDa，等电点约为 pI 8.9，最适pH为7.6-8.0[2]。在pH>5时容易发生自我降解的自溶作用。有机磷化合物和反应物，重金属离子都能抑制胰蛋白酶的活性，卵清、胰脏和豆类植物的种子中都存在着蛋白酶抑制剂[3]。
目前常用苯甲酰-L-精氨酸-对硝基苯胺（BAPNA）和苯甲酰-L-精氨酸-β-萘酰胺（BANA）测定酰胺酶。用对甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯（TAME）和苯甲酰-L-精氨乙酯（BAEE）测定酯酶活力[2]。
1.2 胰蛋白酶的应用
胰蛋白酶在医药、轻工业及科学研究方面具有普遍的应用价值。
1.2.1 医药方面
胰蛋白酶影响着人体的消化，吸收及营养状态，它具有消化蛋白质的作用。常用于消化不良，食欲不振，用于治疗由胰腺功能不敷引起的消化不良，食欲不振及肝脏疾病引起的消化障碍等。尤其适合于慢性胃炎，肝脏病和糖尿病的消化障碍，因此在临床上用于胰腺分泌障碍，消化不良等症状[4]。
1.2.2 轻工业方面
胰蛋白酶在轻工业范畴的操纵集中于食品及水产品加工两方面，操纵其来水解蛋白质和多糖。水解蛋白方面，主要用来水解蚕蛹蛋白、文蛤、海参、鱼类及植物蛋白等与食品工业中价值较高的动植物性蛋白，生产食品、营养强化剂、食品添加剂、调味品、其特点是作用温和，产率较高，无污染[5,6]。
1.2.3 固定化技术
因为液体的胰蛋白酶具有自身降解能力，使体系的反应条件很难掌控，催化反应的效率明显降低，并且使成本提高，研究者正努力研究这种酶的固定化技术，希望进一步提高胰蛋白酶的利用效率[4]。这方面的工作主要集中于固定化载体的选择上。研究表明，采用固定化胰蛋白酶酶解工艺，制备透明质酸成品[5]，水解酪蛋白亲和吸附提取磷肽等均取得了较好的效果。
1.2.4 作为科研工作的工具酶
胰蛋白酶能明显地加强石蜡切片免疫组化的敏感性染色，下降背景。对于经常使用的抗体结合抗原的方法，用胰蛋白酶-尿素联合进行消化，进行免疫酶组织化学染色的方法，获得了相较于单纯胰蛋白酶或尿素消化更好的特异性染色成果[8,9]。探讨胰蛋白酶消化组织块制备原代细胞的最佳浓度，结果表明：0.125％胰蛋白酶为制备大多数种类原代细胞的较为理想的浓度[9]。
1.3 猪胰蛋白酶的提取工艺
酶的分离纯化是酶学研究的基础。作为一种有催化能力的蛋白质，酶的分离纯化方法本质上即为蛋白质的分离纯化法，需遵循蛋白质等生物大分子的分离原则，主要利用它们之间的理化特异性差异进行分离，例如分子大小、形状、酸碱性、溶解度、极性、电荷和与配体分子的亲和性等。胰蛋白酶的分离纯化可分为前处理、粗分级分离和细分级分离三步[9,10]。
常用的分离纯化方法和技术有：沉淀(盐析、有机溶剂沉淀)、离心、透析、凝胶过滤、离子交换层析、亲和层析等。前处理包括组织破碎、沉淀、离心等方法，使细胞内的胰蛋白酶以溶解态游离出来；粗分级分离包括盐析、透析、有机溶剂沉淀等方法，对胰蛋白酶液进行粗步分离，得到混合酶液；细分级分离则多采用层析法，常用离子交换层析和亲和层析，得到胰蛋白酶的纯酶液。胰蛋白酶在中性或碱性溶液中一般以阴离子形式存在，因此离子交换层析通常选用阴离子交换。卢家驹等人用离子交换层析法，对鳜鱼胰蛋白酶进行了分离纯化[11]。根据研究资料显示，在已发表的有关生化分离工艺的文章中，大部分工艺采用了离子交换技术。
在实际操作过程中，多采用硫酸铵沉淀、透析及离子交换层析三步进行提纯，以减少由于操作步骤过多而引起的损耗，以提高胰蛋白酶分离纯化产率。
1.4 本课题研究的目的、意义和内容
动物胰脏如猪胰脏、牛胰脏等含有大量具有生物活性的化合物，如胰岛素、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等。由于胰脏是相当昂贵的而且屠宰量也限制了胰脏的供应，因此应当回收胰脏中大部分的上述物质，从而尽最大可能充分利用动物胰脏。通过对猪胰脏中胰蛋白酶的提取工艺及酶学性质的研究，以期为为今后胰蛋白酶的应用和深入的理论研究提供基础理论据。
2 实验用品
2.1 实验原料
胰酶粉
2.2 实验仪器
表1 主要实验仪器
名称 型号 生产厂家
高速冷冻离心机 J-26xp USA MARCA REG
紫外分光光度计 T6新世纪 北京普析通用仪器有限公司
数显恒温水浴锅 HH-4 国华电器有限公司
磁力搅拌器 90型 上海沪西分析仪器有限公司
冷冻干燥机 LYO GT 2 SYSTEM TECHNIK
2.3 实验药品
表2 主要实验试剂
名称 类型 厂家
考马斯亮蓝G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰（lmax）的位置，由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色。通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质 的量。
1 引言 1
1.1 胰蛋白酶性质 1
1.2 胰蛋白酶的应用 1
1.3 猪胰蛋白酶的提取工艺 3
1.4 本课题研究的目的、意义和内容 3
2 实验用品 3
2.1 实验原料 3
2.2 实验仪器 3
2.3 实验药品 4
3 胰蛋白酶的提取纯化 4
3.1 实验方法 4
3.2 结果与分析 12
4 胰蛋白酶性质的研究 15
4.1 实验方法 15
4.2 结果与分析 13
结 论 19
致 谢 20
参 考 文 献 21
1 引言
胰酶包含有胰蛋白酶、糜蛋白酶、激肽释放酶、羧肽酶、核糖核酸酶等，是常从猪、牛、羊等动物胰脏中获得的多种酶的混合物，经常被作为原料用于医药、工业等行业。在蛋白行业中，胰酶被用于水解大分子蛋白质，得到寡肽、氨基酸等低分子肽类物质。其中胰蛋白酶用途最广泛，用量也最多。但胰酶是多种酶的混合物，因此需要将胰蛋白酶提取并分离纯化。作为一种消化酶、肽链内切酶的胰蛋白酶，在医药、生化等领域发挥着重要的作用，经济价值可观。本实验用猪胰脏粗提的胰酶为研究对象，通过对胰蛋白酶的分离纯化和相关性质研究，建立起一套分离纯化胰蛋白酶的方法，为今后科学研究和工业应用奠定相应的理论和应用基础。
猪胰蛋白酶是一种蛋白质，易变性，因此在整个酶的提取过程中应该避免极端条件，尽可能在比较温和的条件下进行，同时保证在较低的温度下进行操作，以减少酶活的损失。
1.1 胰蛋白酶性质
胰蛋白酶Trypsin(Parenzy *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
me) 是属于蛋白酶的一种，EC3.4.21.4,能在脊椎动物中发挥消化酶的作用。胰蛋白酶作为胰液的成分而分泌，因肠激酶或胰蛋白酶的限制而分解成为活化胰蛋白酶。它是肽链内切酶，能将多肽链中赖氨酸和精氨酸残基中的羧基侧切断[1]。作为特异性最强的蛋白酶，它不但作为消化酶起作用，而且还能限制分解羧肽酶原、糜蛋白酶原、磷脂酶原等其它酶的前体。
胰蛋白酶原的相对分子量约为24 kDa，等电点约为 pI 8.9，最适pH为7.6-8.0[2]。在pH>5时容易发生自我降解的自溶作用。有机磷化合物和反应物，重金属离子都能抑制胰蛋白酶的活性，卵清、胰脏和豆类植物的种子中都存在着蛋白酶抑制剂[3]。
目前常用苯甲酰-L-精氨酸-对硝基苯胺（BAPNA）和苯甲酰-L-精氨酸-β-萘酰胺（BANA）测定酰胺酶。用对甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯（TAME）和苯甲酰-L-精氨乙酯（BAEE）测定酯酶活力[2]。
1.2 胰蛋白酶的应用
胰蛋白酶在医药、轻工业及科学研究方面具有普遍的应用价值。
1.2.1 医药方面
胰蛋白酶影响着人体的消化，吸收及营养状态，它具有消化蛋白质的作用。常用于消化不良，食欲不振，用于治疗由胰腺功能不敷引起的消化不良，食欲不振及肝脏疾病引起的消化障碍等。尤其适合于慢性胃炎，肝脏病和糖尿病的消化障碍，因此在临床上用于胰腺分泌障碍，消化不良等症状[4]。
1.2.2 轻工业方面
胰蛋白酶在轻工业范畴的操纵集中于食品及水产品加工两方面，操纵其来水解蛋白质和多糖。水解蛋白方面，主要用来水解蚕蛹蛋白、文蛤、海参、鱼类及植物蛋白等与食品工业中价值较高的动植物性蛋白，生产食品、营养强化剂、食品添加剂、调味品、其特点是作用温和，产率较高，无污染[5,6]。
1.2.3 固定化技术
因为液体的胰蛋白酶具有自身降解能力，使体系的反应条件很难掌控，催化反应的效率明显降低，并且使成本提高，研究者正努力研究这种酶的固定化技术，希望进一步提高胰蛋白酶的利用效率[4]。这方面的工作主要集中于固定化载体的选择上。研究表明，采用固定化胰蛋白酶酶解工艺，制备透明质酸成品[5]，水解酪蛋白亲和吸附提取磷肽等均取得了较好的效果。
1.2.4 作为科研工作的工具酶
胰蛋白酶能明显地加强石蜡切片免疫组化的敏感性染色，下降背景。对于经常使用的抗体结合抗原的方法，用胰蛋白酶-尿素联合进行消化，进行免疫酶组织化学染色的方法，获得了相较于单纯胰蛋白酶或尿素消化更好的特异性染色成果[8,9]。探讨胰蛋白酶消化组织块制备原代细胞的最佳浓度，结果表明：0.125％胰蛋白酶为制备大多数种类原代细胞的较为理想的浓度[9]。
1.3 猪胰蛋白酶的提取工艺
酶的分离纯化是酶学研究的基础。作为一种有催化能力的蛋白质，酶的分离纯化方法本质上即为蛋白质的分离纯化法，需遵循蛋白质等生物大分子的分离原则，主要利用它们之间的理化特异性差异进行分离，例如分子大小、形状、酸碱性、溶解度、极性、电荷和与配体分子的亲和性等。胰蛋白酶的分离纯化可分为前处理、粗分级分离和细分级分离三步[9,10]。
常用的分离纯化方法和技术有：沉淀(盐析、有机溶剂沉淀)、离心、透析、凝胶过滤、离子交换层析、亲和层析等。前处理包括组织破碎、沉淀、离心等方法，使细胞内的胰蛋白酶以溶解态游离出来；粗分级分离包括盐析、透析、有机溶剂沉淀等方法，对胰蛋白酶液进行粗步分离，得到混合酶液；细分级分离则多采用层析法，常用离子交换层析和亲和层析，得到胰蛋白酶的纯酶液。胰蛋白酶在中性或碱性溶液中一般以阴离子形式存在，因此离子交换层析通常选用阴离子交换。卢家驹等人用离子交换层析法，对鳜鱼胰蛋白酶进行了分离纯化[11]。根据研究资料显示，在已发表的有关生化分离工艺的文章中，大部分工艺采用了离子交换技术。
在实际操作过程中，多采用硫酸铵沉淀、透析及离子交换层析三步进行提纯，以减少由于操作步骤过多而引起的损耗，以提高胰蛋白酶分离纯化产率。
1.4 本课题研究的目的、意义和内容
动物胰脏如猪胰脏、牛胰脏等含有大量具有生物活性的化合物，如胰岛素、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等。由于胰脏是相当昂贵的而且屠宰量也限制了胰脏的供应，因此应当回收胰脏中大部分的上述物质，从而尽最大可能充分利用动物胰脏。通过对猪胰脏中胰蛋白酶的提取工艺及酶学性质的研究，以期为为今后胰蛋白酶的应用和深入的理论研究提供基础理论据。
2 实验用品
2.1 实验原料
胰酶粉
2.2 实验仪器
表1 主要实验仪器
名称 型号 生产厂家
高速冷冻离心机 J-26xp USA MARCA REG
紫外分光光度计 T6新世纪 北京普析通用仪器有限公司
数显恒温水浴锅 HH-4 国华电器有限公司
磁力搅拌器 90型 上海沪西分析仪器有限公司
冷冻干燥机 LYO GT 2 SYSTEM TECHNIK
2.3 实验药品
表2 主要实验试剂
名称 类型 厂家
考马斯亮蓝G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰（lmax
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