生物发酵法生产无硝捆蹄的研究胡萝卜来源
目 录
1 引言 1
1.1 亚硝酸盐 1
1.2 研究目的与意义 2
1.3 亚硝酸盐替代物 2
2 材料与方法 3
2.1 材料 3
2.2 试剂与设备 3
2.3 实验方法 4
3 结果与讨论 9
3.1 菌种生理生化特性 9
3.2 胡萝卜粉中亚硝酸盐和硝酸盐含量 14
3.3 胡萝卜粉对捆蹄品质影响的研究 14
结 论 17
致 谢 18
参 考 文 献 191 引言
捆蹄作为淮扬菜系中极具特色的一道名菜[1]，有着悠久的历史，工艺精细。捆蹄是以猪蹄髈肉和瘦肉为原料加工的一类传统食品，深受广大群众喜欢，捆蹄皮酥肉嫩，鲜香可口，而且有着它独特的风味。
捆蹄属于腌肉制品，在传统的腌肉制品加工工艺中，亚硝酸盐是直接被添加到肉制品中的。添加到肉制品中的亚硝酸盐是不可被完全替代的多功能食品添加剂，因为亚硝酸盐具有形成特征色泽、抑制肉毒梭状芽胞杆菌的生长、抗氧化[2]、增强风味等重要功能。但目前广大人民群众已经知道了亚硝酸盐的危害，而且现在消费者越来越关注和重视腌肉食品的安全问题，天然的有机腌肉制品越来越受到人们的欢迎和追捧，消费者对人工合成的事物慢慢的形成了排斥心理，而亚硝酸盐正是一种人工合成的添加剂，存在着一定的隐患，比如它可以形成可致癌的N-亚硝胺[3]，也因此消费者在考虑是否要购买时会存在一定的顾虑，也因此寻求能够替代亚硝酸盐的物质已经成为热门课题。据了解亚硝酸钠的国家标准最大使用量为0.15g/kg，最大残留量为肉类罐头不得超过0.05g/kg，肉制品不得超过0.03g/kg[4]。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
1．1 亚硝酸盐
1.1.1 亚硝酸盐的作用
在捆蹄的加工过程中，硝酸盐和亚硝酸盐的作用十分重要。而且我们知道硝酸盐可以在硝酸盐还原酶的作用下转化成为亚硝酸盐，并且因为亚硝酸盐非常不稳定容易在酸性条件下分解并产生能与肌红蛋白、血红蛋白结合产生亚硝基肌红蛋白的一氧化氮(NO)。亚硝酸盐能够使肉制品的的色泽保持稳定的鲜红色，并且使其具有独特的风味，以迎合消费者的喜好。亚硝酸盐另外还具有能够抑制肉毒梭状芽孢杆菌的生长和繁殖的作用，从而来防止肉毒毒素的产生。除了这些作用，亚硝酸盐还具有抗氧化作用，能够抑制肉制品的氧化和酸败。
1.1.2 亚硝酸盐的危害
亚硝酸盐是起到发色、抑菌、抗氧化和提高风味这4方面作用的物质，到现在尚且没有发现存在任何一种物质完全可以替代它，但是它存在的隐患是非常大的。因为亚硝酸盐能够和仲胺、氨基酸等肉制品中的次级胺发生反应，所以能够形成对人体有害的致癌物质N-亚硝基化合物，包括有N-亚硝胺二甲基、N-亚硝胺二乙基、N-亚硝基吡咯烷、N- 亚硝基二丁胺等，从而诱发人体消化系统发生癌变，对人体造成伤害，目前这种情况已经成为食品安全关注的焦点[5]。
由于人体吸收了过量的亚硝酸盐后，机体分解转化亚硝酸盐的时间不够，导致大量亚硝酸盐残留以至于被大量地吸收进入血液，它的还原性可将血红蛋白中的亚铁离子迅速转化为铁离子，快速地将正常的血红蛋白被氧化为高铁血红蛋白[6]，由此大大增加了高铁血红蛋白的含量，同样的血红蛋白就丧失了它的携氧功能，在这种情况下还会影响甚至阻碍正常的血红蛋白释放氧，以至于最后造成的结果是机体组织缺氧，引发呼吸情况困难、血压下降等症状，更有甚者严重的可能导致昏迷惊厥、抽筋、大小便失禁、呼吸衰竭而死亡[7]。
亚硝酸盐在酸性条件下可分解生成亚硝酸，由于亚硝酸的性质非常不稳定，亚硝酸容易分解产生亚硝基。然而亚硝基能够与人体的蛋白质代谢产物仲胺类化合物结合生成亚硝胺。研究表明，亚硝胺对人体具有致突变、致畸、致癌的作用。人体胃液的pH值低，适合亚硝胺类物质的生成，所以亚硝酸盐的摄入量不容忽视[8]。另外，亚硝酸盐的大量摄入能够干扰碘的代谢，使甲状腺摄取碘的能力下降，从而造成甲状腺肿大；还可以松弛血管的平滑肌，可使末梢血管扩张而导致外周循环衰竭[9]。
因为亚硝酸盐与N-亚硝胺和癌症之间存在着潜在的关系，关于硝酸盐或者亚硝酸盐能够作为食品添加剂这一情况，大多数消费者持有否定态度。而且美国农业部也明确规定生产绿色食品禁止使用硝酸盐或亚硝酸盐等作为食品添加剂[10]。我国的食品添加剂使用准则也是这么规定的。
1.2 研究目的与意义
如今，许多人为了能够生产出更加安全和放心的腌肉制品，一直致力于研发无硝肉制品，从而制造出人们放心的安全食品。无硝肉制品即为不添加亚硝酸盐的肉制品并且是对人体无害的肉制品，根据硝酸盐或亚硝酸盐所具备的作用，进行实验研究来寻找能够替代的物质来进行发色、抑菌、抗氧化和提高风味。
1.3 亚硝酸盐替代物
蔬菜作为一种天然物质，富含硝酸盐[11]，但是蔬菜种类的不同、同一种蔬菜组织器官的不同、栽培方式的不同或者栽培季节的不同这些都能导致蔬菜中的硝酸盐含量的不同，比如说种类不同的蔬菜，硝酸盐含量有着较大的差异，其中菠菜的硝酸盐含量为3369~7615 mg *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
/kg、芹菜的硝酸盐含量为2274~5123mg/kg、胡萝卜的硝酸盐含量为1166~3672 mg/kg[12]。但是蔬菜中所含的硝酸盐在一定的条件下可以还原成亚硝酸盐，如果胡萝卜汁、芹菜汁和菠菜汁在室温下储藏10 d，那它们的硝酸盐含量就会发生变化，大概会减少14%~22%，而亚硝酸盐含量则会增加，会由痕量增加至128~l89mg/kg。因此，添加蔬菜（汁/粉）到肉制品加工过程中的工艺，可以达到完全替代或部分替代直接添加化学合成的亚硝酸盐的效果，此外添加蔬菜粉还可提高肉制品中膳食纤维等的营养价值，从食品安全角度来讲，这种方法是安全可靠的。由此看来，在生产捆蹄的过程中，可以用硝酸盐含量丰富的蔬菜与硝酸盐还原菌发酵来产生亚硝酸盐的方法来代替直接在捆蹄加工过程中添加化学合成的硝酸盐或亚硝酸盐。
研究发现，木糖葡萄球菌、肉葡萄球菌和一些微球菌是主要的产硝酸还原酶的微生物，在氧气浓度很低或者厌氧的条件下，这些硝酸还原酶可以催化硝酸根离子还原成亚硝酸根离子[13,14]。通过对木糖葡萄球菌和肉糖葡萄球菌在发酵捆蹄中的研究，得知两菌株均可用为发酵剂用于将胡萝卜粉中的硝酸盐还原成亚硝酸盐，从而达到天然发酵捆蹄的工艺。王永霞和于长青分别利用肉葡萄球菌和木糖葡萄球菌的硝酸还原性，对传统发酵肉中的优良发酵菌进行了分离和筛选[15,16]。
因此，在研究天然发酵生产捆蹄的过程中，可以通过对菌种、温度、时间、蔬菜粉添加量等因素的测定来获得理想的工艺以达到控制亚硝酸盐的含量的目的。
2 材料与方法
2.1 材料
实验菌种：木糖葡萄球菌、肉糖葡萄球菌均购于广东省微生物保藏中心。.
在50 mL烧杯中称取5g的胡萝卜粉，尽量精确以减少误差，向烧杯中加入12.5 mL之前配好的饱和硼砂溶液，并且用玻璃棒将胡萝卜粉与硼砂溶液进行搅拌，不要使胡萝卜粉大量粘附在烧杯瓶壁。用大约300 mL70 ℃左右的水将搅拌均匀的试样倒入容量为500 mL的容量瓶中，将试样完全干净地倒入，不要残留在烧杯中。在做实验前提前打开水浴锅，将容量瓶放置在沸水浴中加热15 min，待取出后将容量瓶放在冷水浴中使之快速冷却，直至室温状态，在这个步骤中要注意避免容量瓶爆裂。然后振荡容量瓶并且向其中加入5 mL的亚铁氰化钾溶液，再次摇匀后加入5 mL乙酸锌溶液，添加蒸馏水至容量瓶的刻度并摇匀，然后静置30min。静置过后，溶液出现明显分层，先除去上层脂肪，要避免幅度过大溶液再次浑浊，再用漏斗过滤上清液，但是要弃去30 mL的初滤液，吸取弃去后的40.0 mL滤液倒入50 mL的带塞比色管中待测，另外在同型号的带塞比色管中放入吸取的0.00 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL、1.00 mL、1.50 mL、2.00 mL、2.50 mL的亚硝酸钠标准使用液，于每个比色管中加入2 mL的对氨基苯磺酸溶液，混匀并静置3 min~5 min，而后各加入1 mL的盐酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混匀，静置15 min后用来检测。使用零管来调节零点，在波长为538 nm处测定吸光值，并且绘制亚硝酸盐标准曲线。同时做空白对照。
1 引言 1
1.1 亚硝酸盐 1
1.2 研究目的与意义 2
1.3 亚硝酸盐替代物 2
2 材料与方法 3
2.1 材料 3
2.2 试剂与设备 3
2.3 实验方法 4
3 结果与讨论 9
3.1 菌种生理生化特性 9
3.2 胡萝卜粉中亚硝酸盐和硝酸盐含量 14
3.3 胡萝卜粉对捆蹄品质影响的研究 14
结 论 17
致 谢 18
参 考 文 献 191 引言
捆蹄作为淮扬菜系中极具特色的一道名菜[1]，有着悠久的历史，工艺精细。捆蹄是以猪蹄髈肉和瘦肉为原料加工的一类传统食品，深受广大群众喜欢，捆蹄皮酥肉嫩，鲜香可口，而且有着它独特的风味。
捆蹄属于腌肉制品，在传统的腌肉制品加工工艺中，亚硝酸盐是直接被添加到肉制品中的。添加到肉制品中的亚硝酸盐是不可被完全替代的多功能食品添加剂，因为亚硝酸盐具有形成特征色泽、抑制肉毒梭状芽胞杆菌的生长、抗氧化[2]、增强风味等重要功能。但目前广大人民群众已经知道了亚硝酸盐的危害，而且现在消费者越来越关注和重视腌肉食品的安全问题，天然的有机腌肉制品越来越受到人们的欢迎和追捧，消费者对人工合成的事物慢慢的形成了排斥心理，而亚硝酸盐正是一种人工合成的添加剂，存在着一定的隐患，比如它可以形成可致癌的N-亚硝胺[3]，也因此消费者在考虑是否要购买时会存在一定的顾虑，也因此寻求能够替代亚硝酸盐的物质已经成为热门课题。据了解亚硝酸钠的国家标准最大使用量为0.15g/kg，最大残留量为肉类罐头不得超过0.05g/kg，肉制品不得超过0.03g/kg[4]。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
1．1 亚硝酸盐
1.1.1 亚硝酸盐的作用
在捆蹄的加工过程中，硝酸盐和亚硝酸盐的作用十分重要。而且我们知道硝酸盐可以在硝酸盐还原酶的作用下转化成为亚硝酸盐，并且因为亚硝酸盐非常不稳定容易在酸性条件下分解并产生能与肌红蛋白、血红蛋白结合产生亚硝基肌红蛋白的一氧化氮(NO)。亚硝酸盐能够使肉制品的的色泽保持稳定的鲜红色，并且使其具有独特的风味，以迎合消费者的喜好。亚硝酸盐另外还具有能够抑制肉毒梭状芽孢杆菌的生长和繁殖的作用，从而来防止肉毒毒素的产生。除了这些作用，亚硝酸盐还具有抗氧化作用，能够抑制肉制品的氧化和酸败。
1.1.2 亚硝酸盐的危害
亚硝酸盐是起到发色、抑菌、抗氧化和提高风味这4方面作用的物质，到现在尚且没有发现存在任何一种物质完全可以替代它，但是它存在的隐患是非常大的。因为亚硝酸盐能够和仲胺、氨基酸等肉制品中的次级胺发生反应，所以能够形成对人体有害的致癌物质N-亚硝基化合物，包括有N-亚硝胺二甲基、N-亚硝胺二乙基、N-亚硝基吡咯烷、N- 亚硝基二丁胺等，从而诱发人体消化系统发生癌变，对人体造成伤害，目前这种情况已经成为食品安全关注的焦点[5]。
由于人体吸收了过量的亚硝酸盐后，机体分解转化亚硝酸盐的时间不够，导致大量亚硝酸盐残留以至于被大量地吸收进入血液，它的还原性可将血红蛋白中的亚铁离子迅速转化为铁离子，快速地将正常的血红蛋白被氧化为高铁血红蛋白[6]，由此大大增加了高铁血红蛋白的含量，同样的血红蛋白就丧失了它的携氧功能，在这种情况下还会影响甚至阻碍正常的血红蛋白释放氧，以至于最后造成的结果是机体组织缺氧，引发呼吸情况困难、血压下降等症状，更有甚者严重的可能导致昏迷惊厥、抽筋、大小便失禁、呼吸衰竭而死亡[7]。
亚硝酸盐在酸性条件下可分解生成亚硝酸，由于亚硝酸的性质非常不稳定，亚硝酸容易分解产生亚硝基。然而亚硝基能够与人体的蛋白质代谢产物仲胺类化合物结合生成亚硝胺。研究表明，亚硝胺对人体具有致突变、致畸、致癌的作用。人体胃液的pH值低，适合亚硝胺类物质的生成，所以亚硝酸盐的摄入量不容忽视[8]。另外，亚硝酸盐的大量摄入能够干扰碘的代谢，使甲状腺摄取碘的能力下降，从而造成甲状腺肿大；还可以松弛血管的平滑肌，可使末梢血管扩张而导致外周循环衰竭[9]。
因为亚硝酸盐与N-亚硝胺和癌症之间存在着潜在的关系，关于硝酸盐或者亚硝酸盐能够作为食品添加剂这一情况，大多数消费者持有否定态度。而且美国农业部也明确规定生产绿色食品禁止使用硝酸盐或亚硝酸盐等作为食品添加剂[10]。我国的食品添加剂使用准则也是这么规定的。
1.2 研究目的与意义
如今，许多人为了能够生产出更加安全和放心的腌肉制品，一直致力于研发无硝肉制品，从而制造出人们放心的安全食品。无硝肉制品即为不添加亚硝酸盐的肉制品并且是对人体无害的肉制品，根据硝酸盐或亚硝酸盐所具备的作用，进行实验研究来寻找能够替代的物质来进行发色、抑菌、抗氧化和提高风味。
1.3 亚硝酸盐替代物
蔬菜作为一种天然物质，富含硝酸盐[11]，但是蔬菜种类的不同、同一种蔬菜组织器官的不同、栽培方式的不同或者栽培季节的不同这些都能导致蔬菜中的硝酸盐含量的不同，比如说种类不同的蔬菜，硝酸盐含量有着较大的差异，其中菠菜的硝酸盐含量为3369~7615 mg *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
/kg、芹菜的硝酸盐含量为2274~5123mg/kg、胡萝卜的硝酸盐含量为1166~3672 mg/kg[12]。但是蔬菜中所含的硝酸盐在一定的条件下可以还原成亚硝酸盐，如果胡萝卜汁、芹菜汁和菠菜汁在室温下储藏10 d，那它们的硝酸盐含量就会发生变化，大概会减少14%~22%，而亚硝酸盐含量则会增加，会由痕量增加至128~l89mg/kg。因此，添加蔬菜（汁/粉）到肉制品加工过程中的工艺，可以达到完全替代或部分替代直接添加化学合成的亚硝酸盐的效果，此外添加蔬菜粉还可提高肉制品中膳食纤维等的营养价值，从食品安全角度来讲，这种方法是安全可靠的。由此看来，在生产捆蹄的过程中，可以用硝酸盐含量丰富的蔬菜与硝酸盐还原菌发酵来产生亚硝酸盐的方法来代替直接在捆蹄加工过程中添加化学合成的硝酸盐或亚硝酸盐。
研究发现，木糖葡萄球菌、肉葡萄球菌和一些微球菌是主要的产硝酸还原酶的微生物，在氧气浓度很低或者厌氧的条件下，这些硝酸还原酶可以催化硝酸根离子还原成亚硝酸根离子[13,14]。通过对木糖葡萄球菌和肉糖葡萄球菌在发酵捆蹄中的研究，得知两菌株均可用为发酵剂用于将胡萝卜粉中的硝酸盐还原成亚硝酸盐，从而达到天然发酵捆蹄的工艺。王永霞和于长青分别利用肉葡萄球菌和木糖葡萄球菌的硝酸还原性，对传统发酵肉中的优良发酵菌进行了分离和筛选[15,16]。
因此，在研究天然发酵生产捆蹄的过程中，可以通过对菌种、温度、时间、蔬菜粉添加量等因素的测定来获得理想的工艺以达到控制亚硝酸盐的含量的目的。
2 材料与方法
2.1 材料
实验菌种：木糖葡萄球菌、肉糖葡萄球菌均购于广东省微生物保藏中心。.
在50 mL烧杯中称取5g的胡萝卜粉，尽量精确以减少误差，向烧杯中加入12.5 mL之前配好的饱和硼砂溶液，并且用玻璃棒将胡萝卜粉与硼砂溶液进行搅拌，不要使胡萝卜粉大量粘附在烧杯瓶壁。用大约300 mL70 ℃左右的水将搅拌均匀的试样倒入容量为500 mL的容量瓶中，将试样完全干净地倒入，不要残留在烧杯中。在做实验前提前打开水浴锅，将容量瓶放置在沸水浴中加热15 min，待取出后将容量瓶放在冷水浴中使之快速冷却，直至室温状态，在这个步骤中要注意避免容量瓶爆裂。然后振荡容量瓶并且向其中加入5 mL的亚铁氰化钾溶液，再次摇匀后加入5 mL乙酸锌溶液，添加蒸馏水至容量瓶的刻度并摇匀，然后静置30min。静置过后，溶液出现明显分层，先除去上层脂肪，要避免幅度过大溶液再次浑浊，再用漏斗过滤上清液，但是要弃去30 mL的初滤液，吸取弃去后的40.0 mL滤液倒入50 mL的带塞比色管中待测，另外在同型号的带塞比色管中放入吸取的0.00 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL、1.00 mL、1.50 mL、2.00 mL、2.50 mL的亚硝酸钠标准使用液，于每个比色管中加入2 mL的对氨基苯磺酸溶液，混匀并静置3 min~5 min，而后各加入1 mL的盐酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混匀，静置15 min后用来检测。使用零管来调节零点，在波长为538 nm处测定吸光值，并且绘制亚硝酸盐标准曲线。同时做空白对照。
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