重组漆酶的发酵优化
重组漆酶的发酵优化[20200509183211]
摘要：以大肠杆菌为重组漆酶培养菌，研究对发酵产生漆酶的影响因子。将单因素分析和响应面试验设计应用于重组大肠杆菌漆酶的发酵优化研究。在单因素试验的基础上，采用响应面分析法，探讨了酵母提取物﹑葡萄糖和Cu2+三个因子的交互作用以及最佳水平。通过响应面分析法和Box-Benhnken设计，建立了重组漆酶发酵优化的二次回归模型。优化的重组漆酶发酵条件为：酵母提取物：0.5200g/50mL，葡萄糖：0.0200g/50mL,Cu2+：14.5400mmol/50mL。
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关键字:漆酶；影响因素；优化；响应曲面
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words 1
1 绪论1
1.1 漆酶1
1.2 漆酶的应用1
1.3 重组漆酶的研究现状2
2 材料与方法3
2.1 材料3
2.1.1 菌种3
2.1.2 主要试剂3
2.1.3 培养基3
2.1.4 实验仪器3
2.2 方法3
2.2.1 漆酶的发酵表达3
2.2.2 漆酶粗提液的制备及漆酶酶活的测定4
2.2.3 漆酶分离纯化4
2.2.4 发酵培养基的优化5
2.2.5 响应面试验5
3 结果与分析6
3.1 漆酶分离纯化6
3.2 单因素试验6
3.2.1 酵母提取物的浓度对漆酶酶活的影响6
3.2.2 葡萄糖浓度对漆酶酶活的影响7
3.2.3 乳糖浓度对漆酶酶活的影响7
3.2.4 Cu2+ 浓度对漆酶酶活的影响7
3.3 响应曲面试验8
3.3.1 优化发酵培养基的响应面试验结果及方差分析8
3.3.2 优化发酵培养基的响应面分析 10
4 结论与讨论 12
致谢 12
参考文献 13
重组漆酶的发酵条件优化
引言
1绪论
1.1漆酶
漆酶( laccase，苯二醇：氧 氧化还原酶，EC1. 10. 3. 2) 是一种含铜的多酚氧化酶，与植物中的抗坏血酸氧化酶(ascorbieaci *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$
doxidase)、哺乳动物的血浆铜蓝蛋白(ceruloplasmin)同源，属于蓝铜氧化酶( bluecopperoxidase) 家族中的一员[1, 2]，它能利用分子氧作为电子受体氧化多种类型的酚类化合物及非酚类的化合物，将分子氧还原为水[3]。漆酶、过氧化物酶和酪氨酸酶共同组成了酚类的氧化酶群[4]。
漆酶最早是由一日本学者Yoshida于1883年在日本漆树(Rhus vernicifera)的分泌液中发现的，1894年Bertrand将其命名为漆酶。后来大量研究表明，在自然界中，漆酶广泛的存在于植物、真菌和细菌中[5-7]。
1.2漆酶的应用
漆酶的底物范围很宽，被广泛应用于工业和生物技术方面，如去除含酚的污染物[8]、染料脱色[9, 10]、有机物合成[11]和废水脱色[12]等，是一种新兴的生物修复剂。
由于漆酶具有氧化与木质素有关的酚类和非酚类化合物以及高度难降解环境污染物的能力，因此在食品工业、制浆和造纸工业、纺织工业、土壤的生物修复和纳米生物技术等领域具有广泛的应用前景。
漆酶在食品工业中的应用方面主要用于饮料的澄清与色泽控制[13]，可以用于饮料加工。另外漆酶还可以用于食用菌、药用菌的生产；食物成份功能性的改进；植物食品保护等方面。
1.3重组漆酶的研究现状
过去认为漆酶仅仅存在于植物与真菌中，但是Alexandre G等[15]通过对蛋白质数据库及细菌基因组进行同源性分析，发现漆酶可能广泛存在于原核生物中。1993年首次报道了产漆酶的细菌为生脂固氮螺菌(Azospirillum lipoferum)[16]，之后在单胞菌属 Alteromonas sp. MMB-1[17]、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)[18]、恶臭假单胞菌(Pseudo-monas putida F6)[19]、大肠杆菌( Escherichia coli)[20]和链霉菌属( Streptomyces)[21]、球形芽孢杆菌(Bacillus sphaeri-cus)[22]和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)[23]和嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)[24]等细菌中均发现细菌漆酶的存在。
细菌漆酶与真菌漆酶结构相似，同样含有4个铜结合位点，但全序列却与真菌漆酶不同。所以，其漆酶的反应条件及动力学特征就会与真菌漆酶不同。其反应速度可能会变慢，Cu2+可能成为必要元素，由于这些不同，细菌漆酶只能被称为“多铜氧化酶”或“多酚氧化酶”，其也被定义为漆酶类似物( lac-case-like)[4]。
然而，细菌漆酶比真菌漆酶有更多的优点，如存在Cu2+抗性[25]、不需糖基化、热稳定性好[26]及酶活性的最适pH值范围广[27]等。同时，细菌生长的代时短，所需营养成分简单易得，便于大规模培养；大多数细菌生长在碱性环境中，筛选出最适 pH 在碱性范围内的细菌漆酶，可以直接用于处理工业废水；细菌漆酶对热、卤素和碱的稳定性好，因此，细菌漆酶的研究对漆酶应用的环境条件和领域的扩展具有十分重要的意义。
目前，国际上漆酶已经发展菌种定向优化，基因筛选克隆，表达宿主的筛选，生产工艺优化漆酶的固定化，漆酶结构﹑催化机理与理化性质的研究。多个漆酶基因已被克隆并 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$
实现重组表达,宿主有酵母[酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、 解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)] 和丝状真菌[瑞氏木霉(Trichoderma reesei)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、黑曲霉(Aspergillus niger)、构巢曲霉( Aspergillusnidulans )、云芝( Coriolus versicolor)、灰盖鬼伞菌(Coprinopsis cinerea)] 等。然而，在这些研究中，重组漆酶的产量普遍低于1.0×104u/ L[28]。并且不同来源的漆酶其发酵条件不尽相同。本实验室前期通过筛选鉴定在死亡谷芽孢杆菌中发现漆酶fmb-103，本实验的研究人员通过氮离子束诱变获得性状优良的突变株fmb-820。本实验通过优化菌株fmb-820发酵条件，获得其高产条件，为以后漆酶大规模的生产和应用提供基础。
2材料与方法
2.1材料
2.1.1菌种
菌株fmb-820由本学院酶工程实验室保藏。
2.1.2主要试剂
2, 2’-连氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS) 为Sigma公司产品；氨苄青霉素购自Amresco；胰蛋白陈和酵母粉为Oxoid公司生产；N-Z-amine AS为Sigma公司生产；其它常规试剂均为分析纯。
2.1.3培养基
LB培养基:10g 胰蛋白陈；5g 酵母粉；10g NaCl；1000 mL 蒸馏水。
培英HYL-A全温摇瓶柜： 太仓实验设备厂
UV-2450紫外可见分光光度计： 日本岛津公司
5804 R 高速冷冻离心机： Eppendorf 德国基因公司
图4 Cu2+的浓度对漆酶酶活的影响
摘要：以大肠杆菌为重组漆酶培养菌，研究对发酵产生漆酶的影响因子。将单因素分析和响应面试验设计应用于重组大肠杆菌漆酶的发酵优化研究。在单因素试验的基础上，采用响应面分析法，探讨了酵母提取物﹑葡萄糖和Cu2+三个因子的交互作用以及最佳水平。通过响应面分析法和Box-Benhnken设计，建立了重组漆酶发酵优化的二次回归模型。优化的重组漆酶发酵条件为：酵母提取物：0.5200g/50mL，葡萄糖：0.0200g/50mL,Cu2+：14.5400mmol/50mL。
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关键字:漆酶；影响因素；优化；响应曲面
目录
摘要1
关键词1
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Key words 1
1 绪论1
1.1 漆酶1
1.2 漆酶的应用1
1.3 重组漆酶的研究现状2
2 材料与方法3
2.1 材料3
2.1.1 菌种3
2.1.2 主要试剂3
2.1.3 培养基3
2.1.4 实验仪器3
2.2 方法3
2.2.1 漆酶的发酵表达3
2.2.2 漆酶粗提液的制备及漆酶酶活的测定4
2.2.3 漆酶分离纯化4
2.2.4 发酵培养基的优化5
2.2.5 响应面试验5
3 结果与分析6
3.1 漆酶分离纯化6
3.2 单因素试验6
3.2.1 酵母提取物的浓度对漆酶酶活的影响6
3.2.2 葡萄糖浓度对漆酶酶活的影响7
3.2.3 乳糖浓度对漆酶酶活的影响7
3.2.4 Cu2+ 浓度对漆酶酶活的影响7
3.3 响应曲面试验8
3.3.1 优化发酵培养基的响应面试验结果及方差分析8
3.3.2 优化发酵培养基的响应面分析 10
4 结论与讨论 12
致谢 12
参考文献 13
重组漆酶的发酵条件优化
引言
1绪论
1.1漆酶
漆酶( laccase，苯二醇：氧 氧化还原酶，EC1. 10. 3. 2) 是一种含铜的多酚氧化酶，与植物中的抗坏血酸氧化酶(ascorbieaci *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$
doxidase)、哺乳动物的血浆铜蓝蛋白(ceruloplasmin)同源，属于蓝铜氧化酶( bluecopperoxidase) 家族中的一员[1, 2]，它能利用分子氧作为电子受体氧化多种类型的酚类化合物及非酚类的化合物，将分子氧还原为水[3]。漆酶、过氧化物酶和酪氨酸酶共同组成了酚类的氧化酶群[4]。
漆酶最早是由一日本学者Yoshida于1883年在日本漆树(Rhus vernicifera)的分泌液中发现的，1894年Bertrand将其命名为漆酶。后来大量研究表明，在自然界中，漆酶广泛的存在于植物、真菌和细菌中[5-7]。
1.2漆酶的应用
漆酶的底物范围很宽，被广泛应用于工业和生物技术方面，如去除含酚的污染物[8]、染料脱色[9, 10]、有机物合成[11]和废水脱色[12]等，是一种新兴的生物修复剂。
由于漆酶具有氧化与木质素有关的酚类和非酚类化合物以及高度难降解环境污染物的能力，因此在食品工业、制浆和造纸工业、纺织工业、土壤的生物修复和纳米生物技术等领域具有广泛的应用前景。
漆酶在食品工业中的应用方面主要用于饮料的澄清与色泽控制[13]，可以用于饮料加工。另外漆酶还可以用于食用菌、药用菌的生产；食物成份功能性的改进；植物食品保护等方面。
1.3重组漆酶的研究现状
过去认为漆酶仅仅存在于植物与真菌中，但是Alexandre G等[15]通过对蛋白质数据库及细菌基因组进行同源性分析，发现漆酶可能广泛存在于原核生物中。1993年首次报道了产漆酶的细菌为生脂固氮螺菌(Azospirillum lipoferum)[16]，之后在单胞菌属 Alteromonas sp. MMB-1[17]、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)[18]、恶臭假单胞菌(Pseudo-monas putida F6)[19]、大肠杆菌( Escherichia coli)[20]和链霉菌属( Streptomyces)[21]、球形芽孢杆菌(Bacillus sphaeri-cus)[22]和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)[23]和嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)[24]等细菌中均发现细菌漆酶的存在。
细菌漆酶与真菌漆酶结构相似，同样含有4个铜结合位点，但全序列却与真菌漆酶不同。所以，其漆酶的反应条件及动力学特征就会与真菌漆酶不同。其反应速度可能会变慢，Cu2+可能成为必要元素，由于这些不同，细菌漆酶只能被称为“多铜氧化酶”或“多酚氧化酶”，其也被定义为漆酶类似物( lac-case-like)[4]。
然而，细菌漆酶比真菌漆酶有更多的优点，如存在Cu2+抗性[25]、不需糖基化、热稳定性好[26]及酶活性的最适pH值范围广[27]等。同时，细菌生长的代时短，所需营养成分简单易得，便于大规模培养；大多数细菌生长在碱性环境中，筛选出最适 pH 在碱性范围内的细菌漆酶，可以直接用于处理工业废水；细菌漆酶对热、卤素和碱的稳定性好，因此，细菌漆酶的研究对漆酶应用的环境条件和领域的扩展具有十分重要的意义。
目前，国际上漆酶已经发展菌种定向优化，基因筛选克隆，表达宿主的筛选，生产工艺优化漆酶的固定化，漆酶结构﹑催化机理与理化性质的研究。多个漆酶基因已被克隆并 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$
实现重组表达,宿主有酵母[酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、 解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)] 和丝状真菌[瑞氏木霉(Trichoderma reesei)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、黑曲霉(Aspergillus niger)、构巢曲霉( Aspergillusnidulans )、云芝( Coriolus versicolor)、灰盖鬼伞菌(Coprinopsis cinerea)] 等。然而，在这些研究中，重组漆酶的产量普遍低于1.0×104u/ L[28]。并且不同来源的漆酶其发酵条件不尽相同。本实验室前期通过筛选鉴定在死亡谷芽孢杆菌中发现漆酶fmb-103，本实验的研究人员通过氮离子束诱变获得性状优良的突变株fmb-820。本实验通过优化菌株fmb-820发酵条件，获得其高产条件，为以后漆酶大规模的生产和应用提供基础。
2材料与方法
2.1材料
2.1.1菌种
菌株fmb-820由本学院酶工程实验室保藏。
2.1.2主要试剂
2, 2’-连氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS) 为Sigma公司产品；氨苄青霉素购自Amresco；胰蛋白陈和酵母粉为Oxoid公司生产；N-Z-amine AS为Sigma公司生产；其它常规试剂均为分析纯。
2.1.3培养基
LB培养基:10g 胰蛋白陈；5g 酵母粉；10g NaCl；1000 mL 蒸馏水。
培英HYL-A全温摇瓶柜： 太仓实验设备厂
UV-2450紫外可见分光光度计： 日本岛津公司
5804 R 高速冷冻离心机： Eppendorf 德国基因公司
图4 Cu2+的浓度对漆酶酶活的影响
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