琴川河微生物16srrna基因特征调查研究【字数：8502】
摘 要本文为了研究常熟琴川河内微生物群落基因特征及变化，从琴川河采集水样进行富集培养，再将微生物菌群进行纯种分离后，破碎细菌并且提取出细菌DNA，依据16SrRNA基因的特性设计引物和利用PCR技术扩增DNA，制作出电泳图分析DNA长度，判断PCR参数的合理性，与预计产物大小对比，再利用16SrRNA基因的直接测序法鉴定菌种，对鉴定出的细菌的来源与作用作出分析，从而对常熟琴川河水质环境作出判断。
目 录
1.绪 论 1
1.1研究背景 1
1.1.1微生物的研究背景 1
1.1.2 PCR技术的研究背景 1
1.1.3 16SrRNA序列分析的研究背景 2
1.2研究目的和意义 2
1.3研究现状 2
1.3.1微生物的研究现状 2
1.3.2 16SrRNA序列分析的研究现状 3
1.4主要工作及内容安排 4
2.实验方法 5
2.1富集培养方法 5
2.2纯种分离方法 5
2.3样品采集处理 5
2.4提取细菌DNA模板 5
2.5 PCR扩增 6
2.6琼脂糖凝胶电泳 6
2.7 16SrRNA测序鉴定菌种 7
3.实验材料 8
3.1样品来源 8
3.2培养基 8
3.3试剂 8
3.4仪器与设备 9
4.结果及分析 10
4.1电泳图谱结果及分析 10
4.1.1 电泳图谱结果 10
4.1.2电泳图谱结果的分析 10
4.2 16SrRNA序列比对结果及分析 11
4.2.1 16SrRNA序列比对结果 11
4.2.2 对五组鉴定的细菌的分析 11
5.结论 16
参考文献 17
致谢 18
1.绪 论
1.1研究背景
1.1.1微生物的研究背景
微生物是一切肉眼看不见或看不清的微小生物的总称，其划分的标准仅仅按照其形态大 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
小，可包括属于原核类的细菌(真细菌和古生菌）、放线菌、蓝细菌、支原体、立克次氏体和衣原体[1]。
微生物在整个地球的生态环境中处于“分解者”或“还原者”的地位，因此在环境保护和生态平衡中的地位是其他生物无法代替的，自从18世纪以来，人类过度破坏环境与掠夺自然的资源，而地球上可供给陆地生命的水却仅仅只占其总量的1%不到，水质污染问题层出不穷，日益凸显，已经成为人类所不可忽略的发展问题。而微生物作为地球上的重要的元素循环中的主要推动者，是70%以上的海洋与其他水体中光合生产力的基础，是一切食物链的至关重要的环节，能处理污水与有机废物，以及能作为环境污染和监察中的重要指示生物[2]。
1.1.2 PCR技术的研究背景
多聚酶链式反应(polymerase chain reaction)，简称PCR技术，是80年代中期所发展起来的一种体外扩增特异ＤＮＡ片段的技术。此技术操作简便， 可以在短时间内在试管中获得几百万个特异的目的DNA序列的拷贝数据，PCR技术虽然问世的时间仅仅数年， 但它已迅速进入到分子生物学的各种领域，引起了生物技术发展的一次革命，目前它在分子克隆项目， 目的基础检测项目，遗传病的基因诊断项目，法医学，考古学等方面得到了极为广泛的应用。PCR技术事实上是在模拟体内DNA合成过程，是在模板DNA， 引物以及４种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于ＤＮＡ聚合酶的一种酶促合反应，PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性[3]。 PCR技术的反应分三步，分别是：1.变 性（denaturation）；2.退 火（annealing）；3.延 伸（ex tension）。
1.1.3 16SrRNA序列分析的研究背景
16SrDAN是编码原核生物核糖体小亚基rRNA（16SrRNA）的基因，是细菌分类学研究中最常使用、最有用的“分子钟”。16SrRNA的序列有高度保守的特点，可精准指明细菌之间的亲缘关系，16SrRNA的大小通常为1500bp左右，所包含的信息能反映生物界的进化关系，而且容易操作，适合用于各级分类单元。目前常用方法的是建立在PCR技术基础上的16SrRNA基因的直接测序法，该方法的特点是方便且快捷[4]。
1.2研究目的和意义
本次研究的目的在于调查研究常熟城市内琴川河的水域微生物的菌落数和其16SrRNA基因的特征，并与基因文库的基因信息进行对比分析琴川河水环境中存在未生物的具体种属以及微生物对环境的影响，从而观察出常熟市内水质遭受污染的程度，并且对常熟市水质环保工作情况作出评判，以及对常熟市民日常生活环保习惯作出总结。
1.3研究现状
1.3.1微生物的研究现状
随着人们对微生物的研究的不断深入，人类逐渐能自觉地将微生物为自己服务到各个领域。
在疾控方面，人类通过微生物寻找传染病的病原菌，发明免疫防治法，普及化学治疗剂，筛选抗生素，以及利用基因工程菌生产各种多肽类生物药物，可以说微生物在提高人类寿命方面发挥了至关重要的作用[2]。
在工业生产方面，微生物使得一些古老的酿造工艺获得全新生命力的同时，还催生了大规模工业发酵的新技术。在基因工程、细胞工程、酶工程和生物反应器工程的推动下，又形成了生物工程学，催生出大量新的生物化学品、生物质能源、生物催化、生物转化、生物质炼制、石油开采和细菌冶炼等工业技术分支[2]。
在农业方面，利用微生物研究出的菌治害虫和治植病的生物防治技术、微生物增产技术、食用菌生产技术、沼气发酵技术等，都成为了21世纪农业技术中的闪光点，大幅度推动了农业的发展[2]。
在环保方面，在监察环境变化、处理污水、生态循环中，微生物无一例外都是“主角”。
在生命科学基础研究方面，微生物由于其具有体积小面积大、吸收多转化快、生长旺繁殖快、适应强易变异、分布广种类多的共性，且其培养条件简单，成为了最乐于选用的研究对象，给与人类探索生命科学更简便的道路[5]。
1.3.2 16SrRNA序列分析的研究现状
16SrRNA基因检测技术的应用很广，因为16SrRNA具备高度保守性的特点，所以根据此特点建立起了16SrRNA的基因文库，以此来对生物进行分类和鉴别。
近些年来随着高 通量测序技术及数据分析等方法的不断进步,大量基于16SrRNA 基因的研究使得微生物生态学得到了讯速发展,然而使用16SrRNA基因作为分子标志物的同时也存在许多问题,比如说水平基因的转移、多拷贝的异质性、基因扩增效率的差异、数据分析方法的选择等等,这些问题导致了微生物群落组成和多样性分析时的准确性受到影响。与此同时各种分子生物学技术也可用16SrRNA基因作为 靶基因对不同细菌进行鉴定，此方法可以精确高效地鉴别微生物[6]。
目 录
1.绪 论 1
1.1研究背景 1
1.1.1微生物的研究背景 1
1.1.2 PCR技术的研究背景 1
1.1.3 16SrRNA序列分析的研究背景 2
1.2研究目的和意义 2
1.3研究现状 2
1.3.1微生物的研究现状 2
1.3.2 16SrRNA序列分析的研究现状 3
1.4主要工作及内容安排 4
2.实验方法 5
2.1富集培养方法 5
2.2纯种分离方法 5
2.3样品采集处理 5
2.4提取细菌DNA模板 5
2.5 PCR扩增 6
2.6琼脂糖凝胶电泳 6
2.7 16SrRNA测序鉴定菌种 7
3.实验材料 8
3.1样品来源 8
3.2培养基 8
3.3试剂 8
3.4仪器与设备 9
4.结果及分析 10
4.1电泳图谱结果及分析 10
4.1.1 电泳图谱结果 10
4.1.2电泳图谱结果的分析 10
4.2 16SrRNA序列比对结果及分析 11
4.2.1 16SrRNA序列比对结果 11
4.2.2 对五组鉴定的细菌的分析 11
5.结论 16
参考文献 17
致谢 18
1.绪 论
1.1研究背景
1.1.1微生物的研究背景
微生物是一切肉眼看不见或看不清的微小生物的总称，其划分的标准仅仅按照其形态大 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
小，可包括属于原核类的细菌(真细菌和古生菌）、放线菌、蓝细菌、支原体、立克次氏体和衣原体[1]。
微生物在整个地球的生态环境中处于“分解者”或“还原者”的地位，因此在环境保护和生态平衡中的地位是其他生物无法代替的，自从18世纪以来，人类过度破坏环境与掠夺自然的资源，而地球上可供给陆地生命的水却仅仅只占其总量的1%不到，水质污染问题层出不穷，日益凸显，已经成为人类所不可忽略的发展问题。而微生物作为地球上的重要的元素循环中的主要推动者，是70%以上的海洋与其他水体中光合生产力的基础，是一切食物链的至关重要的环节，能处理污水与有机废物，以及能作为环境污染和监察中的重要指示生物[2]。
1.1.2 PCR技术的研究背景
多聚酶链式反应(polymerase chain reaction)，简称PCR技术，是80年代中期所发展起来的一种体外扩增特异ＤＮＡ片段的技术。此技术操作简便， 可以在短时间内在试管中获得几百万个特异的目的DNA序列的拷贝数据，PCR技术虽然问世的时间仅仅数年， 但它已迅速进入到分子生物学的各种领域，引起了生物技术发展的一次革命，目前它在分子克隆项目， 目的基础检测项目，遗传病的基因诊断项目，法医学，考古学等方面得到了极为广泛的应用。PCR技术事实上是在模拟体内DNA合成过程，是在模板DNA， 引物以及４种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于ＤＮＡ聚合酶的一种酶促合反应，PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性[3]。 PCR技术的反应分三步，分别是：1.变 性（denaturation）；2.退 火（annealing）；3.延 伸（ex tension）。
1.1.3 16SrRNA序列分析的研究背景
16SrDAN是编码原核生物核糖体小亚基rRNA（16SrRNA）的基因，是细菌分类学研究中最常使用、最有用的“分子钟”。16SrRNA的序列有高度保守的特点，可精准指明细菌之间的亲缘关系，16SrRNA的大小通常为1500bp左右，所包含的信息能反映生物界的进化关系，而且容易操作，适合用于各级分类单元。目前常用方法的是建立在PCR技术基础上的16SrRNA基因的直接测序法，该方法的特点是方便且快捷[4]。
1.2研究目的和意义
本次研究的目的在于调查研究常熟城市内琴川河的水域微生物的菌落数和其16SrRNA基因的特征，并与基因文库的基因信息进行对比分析琴川河水环境中存在未生物的具体种属以及微生物对环境的影响，从而观察出常熟市内水质遭受污染的程度，并且对常熟市水质环保工作情况作出评判，以及对常熟市民日常生活环保习惯作出总结。
1.3研究现状
1.3.1微生物的研究现状
随着人们对微生物的研究的不断深入，人类逐渐能自觉地将微生物为自己服务到各个领域。
在疾控方面，人类通过微生物寻找传染病的病原菌，发明免疫防治法，普及化学治疗剂，筛选抗生素，以及利用基因工程菌生产各种多肽类生物药物，可以说微生物在提高人类寿命方面发挥了至关重要的作用[2]。
在工业生产方面，微生物使得一些古老的酿造工艺获得全新生命力的同时，还催生了大规模工业发酵的新技术。在基因工程、细胞工程、酶工程和生物反应器工程的推动下，又形成了生物工程学，催生出大量新的生物化学品、生物质能源、生物催化、生物转化、生物质炼制、石油开采和细菌冶炼等工业技术分支[2]。
在农业方面，利用微生物研究出的菌治害虫和治植病的生物防治技术、微生物增产技术、食用菌生产技术、沼气发酵技术等，都成为了21世纪农业技术中的闪光点，大幅度推动了农业的发展[2]。
在环保方面，在监察环境变化、处理污水、生态循环中，微生物无一例外都是“主角”。
在生命科学基础研究方面，微生物由于其具有体积小面积大、吸收多转化快、生长旺繁殖快、适应强易变异、分布广种类多的共性，且其培养条件简单，成为了最乐于选用的研究对象，给与人类探索生命科学更简便的道路[5]。
1.3.2 16SrRNA序列分析的研究现状
16SrRNA基因检测技术的应用很广，因为16SrRNA具备高度保守性的特点，所以根据此特点建立起了16SrRNA的基因文库，以此来对生物进行分类和鉴别。
近些年来随着高 通量测序技术及数据分析等方法的不断进步,大量基于16SrRNA 基因的研究使得微生物生态学得到了讯速发展,然而使用16SrRNA基因作为分子标志物的同时也存在许多问题,比如说水平基因的转移、多拷贝的异质性、基因扩增效率的差异、数据分析方法的选择等等,这些问题导致了微生物群落组成和多样性分析时的准确性受到影响。与此同时各种分子生物学技术也可用16SrRNA基因作为 靶基因对不同细菌进行鉴定，此方法可以精确高效地鉴别微生物[6]。
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