甜椒成熟衰老期间蛋白质双向电泳技术体系的建立
甜椒成熟衰老期间蛋白质双向电泳技术体系的建立[20200509183456]
摘要：以甜椒果实“红方”为实验材料，对其果实总蛋白制备方法、蛋白提取液的pH值、总蛋白的上样量、IPG胶条的pH范围及等电聚焦程序进行条件优化，建立了适用于甜椒果实总蛋白分析的双向电泳体系。结果表明，采用提取液为pH7.8的改良酚提法制备的甜椒果实总蛋白、17cm pH5-8的IPG胶条、上样量1200 μg进行66000VH等电聚焦和垂直凝胶电泳，经过考马斯亮蓝G-250胶体考染后得到可用于进一步质谱分析的电泳图谱，图谱中总蛋白点达到700以上，蛋白点分布均匀、背景清晰、分辨率高，能满足后续质谱分析的需要。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
关键字:甜椒果实；蛋白质组学；双向电泳
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract. 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1．1 材料 2
1．2 试剂 2
1．3 仪器与设备 2
1．4 方法 2
1．4．1 蛋白质制备方法 2
1．4．1．1 TCA-丙酮法 2
1．4．1．2 TCA丙酮-SDS法 2
1．4．1．3 酚提法 3
1．4．1．4 TCA丙酮-酚提法 3
1．4．2 蛋白质的溶解 3
1．4．3 蛋白质含量的测定 3
1．5 双向电泳 3
1．5．1 等电聚焦 3
1．5．2 IPG胶条的平衡 4
1．5．3 第二向SDS-PAGE 4
1．5．4 染色 4
1．6 凝胶图像采集与分析 4
1．7 数据处理与分析 4
2 结果与分析 4
2．1 不同总蛋白的制备方法对甜椒果实蛋白质2-DE图谱的影响 4
2．2 提取液不同pH条件对甜椒果实蛋白质2-DE图谱的影响 5
2．3 不同上样量对甜椒果实蛋白质2-DE图谱的影响 6
2．4 不同pH范围胶条对甜椒果实蛋白质2-DE图谱的影响 6
2．5 不同等电聚焦程序对甜椒果实蛋白质2-DE图谱的影响 7
3 讨论 8
致谢 8
参考文献 8
甜椒成熟衰老期间蛋白质双向电泳技术体系的建立
引言 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
甜椒（Capsicum annuum L.）又名菜椒，灯笼椒，柿子椒，是茄科辣椒属辣椒的一个变种，分布于中国南北各地，属于“非人工引种栽培”类型植物[1]。甜椒果实富含维生素C，微量元素和维生素K，并且其口感独特，受到广大消费者的喜爱，更是百姓餐桌上的常见蔬菜。甜椒果实在采后仍是一个生命有机体，其生理代谢活动依旧十分旺盛，贮运过程中易由于环境因素影响出现失水、衰老、腐烂等现象[2, 3]，严重影响了果实的食用品质和商品性。根据国内外文献报道来看，对于甜椒果实采后的相关研究主要集中在应用方面，例如不同的保藏方式对甜椒果实的影响，研究内容涉及到货架期[4]、感官品质[5]、抗氧化成分[6, 7]、能量代谢产物[8]等方面。
近年来，果实采后相关的蛋白质组学的研究已经开展起来，并且有较显著的进展。采后果实蛋白质组学的研究主要集中在果实成熟衰老过程中的蛋白质组的变化。Linda[9]等对不同成熟度的草莓进行了蛋白质组学研究，鉴定出与成熟相关的蛋白：类黄酮合成4种，气味合成2种，氧化胁迫2种。Yun[10]等研究了在4 ℃低温下贮藏期不同的柑橘，鉴定了56个差异蛋白，与糖代谢、氨基酸代谢、环境胁迫等有关。Zhang[11]等对桃果实进行热处理实验，经过蛋白质组学分析发现，有30个蛋白达到2倍差异表达，这些蛋白主要参与了胁迫反应和防御、细胞结构、蛋白代谢、能量代谢、成熟衰老，还有大概17%为功能未知。利用越发成熟的双向电泳技术将会为果蔬采后生理的研究带来更多的便利，然而原料品种的差异性需要针对性的优化双向电泳体系，以便目标对象获得优质的电泳图谱和可靠的实验结果。
目前对于辣椒蛋白质组学的研究很少，仅有关于植株叶片病害蛋白质变化[12]、果实发育过程辣胎盘的蛋白差异[13]、有色体蛋白组分析[14]等。利用蛋白质组学的研究方法来揭示果实贮藏期后熟衰老机理的研究只有Paloma Sánchez-Bel[15]等有关甜椒果实的冷害机制研究。本研究期望通过甜椒果实总蛋白制备、双向电泳程序、上样量等甜椒果实总蛋白双向电泳体系建立为后续果实成熟衰老机理和调控机制的深入研究提供技术平台。
1 材料与方法
1．1 材料
实验材料为“红方”甜椒果实，甜椒采后立即运回实验室，充分散去田间热后，选择果形整齐、大小均匀一致、无病虫害、无机械损伤且成熟度一致的果实作为实验材料。
1．2 试剂
固化pH梯度干胶条（IPG）、两性电解质（Bio-Lyte）、碘代乙酰胺（IAA）、四甲基乙二胺（TEMED）等购自美国Bio-Rad公司；二硫苏糖醇（DTT）、丙烯酰胺（Arc）、NN-甲叉双丙烯酰胺（Bis）、二甲氨基丙磺酸（CHAPS）、低熔点琼脂糖（LMP）、考马斯亮蓝G-250、尿素（Urea）、硫脲（Thiourea）、甘氨酸（Glycine）、β-巯基乙醇（β-Me）、十二烷基磺酸钠（SDS）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、矿物油（Mineral oil）、过硫酸铵（Aps）、Tris-平衡酚等购自Sigma公司；三氯乙酸（TCA）、丙酮、甲醇、乙酸铵、硫酸铵、牛血清蛋白（BSA）等均为国产分析纯。
1．3 仪器与设备
等电聚焦电泳系统（Protein I 12 IEF 美国伯乐公司 美国）；高重复性高通量大型垂直电泳（EttanDALT Twe *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
lve GE-061-TY7119 GE Healthcare 美国）；Image Scanner Ⅲ 扫描仪（28-9076-07 GE Healthcare 美国）；精密电子天平（DJ300 北京赛多利斯仪器系统有限公司 上海）；恒温磁力搅拌器（85-1 常州国华电器有限公司 常州）；高速冷冻离心机（GL-20G-Ⅱ 上海安亭科学仪器厂 上海）；数显恒温水浴锅（HH-6 常州国华电器有限公司 常州）；台面式pH/ISE测试仪（Orion86802 上海纳锘仪器有限公司 美国）；微型旋涡混合仪（XW-80A 上海沪西分析仪器厂有限公司 上海）；紫外-可见分光光度计（WFJ UV-2802 PC 尤尼柯(上海)仪器有限公司 上海）等。
1．4 方法
1．4．1 蛋白质制备方法
1．4．1．1 TCA-丙酮法[16]
称取5 g果肉，加2% (w/w) PVPP[15]用液氮在研钵中将其研磨成粉。然后加入5倍体积-20 ℃预冷的10% (w/v) TCA 内含0.07% (v/v) β-巯基乙醇，匀浆液于-20 ℃下过夜培养。10000×g离心30 min，收集沉淀。沉淀用冷丙酮冲洗3次，4 ℃下干燥后保存于-20 ℃备用。
1．4．1．2 TCA丙酮-SDS法
参照张丽等[17]的方法并稍加改进。称取5 g果肉，加2% (w/w) PVPP用液氮在研钵中研磨成粉。加入10 mL的SDS缓冲液(缓冲液中含有33 mmolL-1 Tris-HCl (pH 7.8)，7.5% (w/v) 蔗糖，5% (v/v) β-巯基乙醇，2% (w/v) SDS)。再以10000×g离心30 min。将上清液转移到新的离心管中，加入终浓度为10% (w/v) 的TCA溶液，-20 ℃下放置2 h，10000×g离心30 min，收集沉淀。用冷丙酮冲洗3次，4 ℃下干燥后保存于-20 ℃备用。
摘要：以甜椒果实“红方”为实验材料，对其果实总蛋白制备方法、蛋白提取液的pH值、总蛋白的上样量、IPG胶条的pH范围及等电聚焦程序进行条件优化，建立了适用于甜椒果实总蛋白分析的双向电泳体系。结果表明，采用提取液为pH7.8的改良酚提法制备的甜椒果实总蛋白、17cm pH5-8的IPG胶条、上样量1200 μg进行66000VH等电聚焦和垂直凝胶电泳，经过考马斯亮蓝G-250胶体考染后得到可用于进一步质谱分析的电泳图谱，图谱中总蛋白点达到700以上，蛋白点分布均匀、背景清晰、分辨率高，能满足后续质谱分析的需要。
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关键字:甜椒果实；蛋白质组学；双向电泳
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract. 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1．1 材料 2
1．2 试剂 2
1．3 仪器与设备 2
1．4 方法 2
1．4．1 蛋白质制备方法 2
1．4．1．1 TCA-丙酮法 2
1．4．1．2 TCA丙酮-SDS法 2
1．4．1．3 酚提法 3
1．4．1．4 TCA丙酮-酚提法 3
1．4．2 蛋白质的溶解 3
1．4．3 蛋白质含量的测定 3
1．5 双向电泳 3
1．5．1 等电聚焦 3
1．5．2 IPG胶条的平衡 4
1．5．3 第二向SDS-PAGE 4
1．5．4 染色 4
1．6 凝胶图像采集与分析 4
1．7 数据处理与分析 4
2 结果与分析 4
2．1 不同总蛋白的制备方法对甜椒果实蛋白质2-DE图谱的影响 4
2．2 提取液不同pH条件对甜椒果实蛋白质2-DE图谱的影响 5
2．3 不同上样量对甜椒果实蛋白质2-DE图谱的影响 6
2．4 不同pH范围胶条对甜椒果实蛋白质2-DE图谱的影响 6
2．5 不同等电聚焦程序对甜椒果实蛋白质2-DE图谱的影响 7
3 讨论 8
致谢 8
参考文献 8
甜椒成熟衰老期间蛋白质双向电泳技术体系的建立
引言 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
甜椒（Capsicum annuum L.）又名菜椒，灯笼椒，柿子椒，是茄科辣椒属辣椒的一个变种，分布于中国南北各地，属于“非人工引种栽培”类型植物[1]。甜椒果实富含维生素C，微量元素和维生素K，并且其口感独特，受到广大消费者的喜爱，更是百姓餐桌上的常见蔬菜。甜椒果实在采后仍是一个生命有机体，其生理代谢活动依旧十分旺盛，贮运过程中易由于环境因素影响出现失水、衰老、腐烂等现象[2, 3]，严重影响了果实的食用品质和商品性。根据国内外文献报道来看，对于甜椒果实采后的相关研究主要集中在应用方面，例如不同的保藏方式对甜椒果实的影响，研究内容涉及到货架期[4]、感官品质[5]、抗氧化成分[6, 7]、能量代谢产物[8]等方面。
近年来，果实采后相关的蛋白质组学的研究已经开展起来，并且有较显著的进展。采后果实蛋白质组学的研究主要集中在果实成熟衰老过程中的蛋白质组的变化。Linda[9]等对不同成熟度的草莓进行了蛋白质组学研究，鉴定出与成熟相关的蛋白：类黄酮合成4种，气味合成2种，氧化胁迫2种。Yun[10]等研究了在4 ℃低温下贮藏期不同的柑橘，鉴定了56个差异蛋白，与糖代谢、氨基酸代谢、环境胁迫等有关。Zhang[11]等对桃果实进行热处理实验，经过蛋白质组学分析发现，有30个蛋白达到2倍差异表达，这些蛋白主要参与了胁迫反应和防御、细胞结构、蛋白代谢、能量代谢、成熟衰老，还有大概17%为功能未知。利用越发成熟的双向电泳技术将会为果蔬采后生理的研究带来更多的便利，然而原料品种的差异性需要针对性的优化双向电泳体系，以便目标对象获得优质的电泳图谱和可靠的实验结果。
目前对于辣椒蛋白质组学的研究很少，仅有关于植株叶片病害蛋白质变化[12]、果实发育过程辣胎盘的蛋白差异[13]、有色体蛋白组分析[14]等。利用蛋白质组学的研究方法来揭示果实贮藏期后熟衰老机理的研究只有Paloma Sánchez-Bel[15]等有关甜椒果实的冷害机制研究。本研究期望通过甜椒果实总蛋白制备、双向电泳程序、上样量等甜椒果实总蛋白双向电泳体系建立为后续果实成熟衰老机理和调控机制的深入研究提供技术平台。
1 材料与方法
1．1 材料
实验材料为“红方”甜椒果实，甜椒采后立即运回实验室，充分散去田间热后，选择果形整齐、大小均匀一致、无病虫害、无机械损伤且成熟度一致的果实作为实验材料。
1．2 试剂
固化pH梯度干胶条（IPG）、两性电解质（Bio-Lyte）、碘代乙酰胺（IAA）、四甲基乙二胺（TEMED）等购自美国Bio-Rad公司；二硫苏糖醇（DTT）、丙烯酰胺（Arc）、NN-甲叉双丙烯酰胺（Bis）、二甲氨基丙磺酸（CHAPS）、低熔点琼脂糖（LMP）、考马斯亮蓝G-250、尿素（Urea）、硫脲（Thiourea）、甘氨酸（Glycine）、β-巯基乙醇（β-Me）、十二烷基磺酸钠（SDS）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、矿物油（Mineral oil）、过硫酸铵（Aps）、Tris-平衡酚等购自Sigma公司；三氯乙酸（TCA）、丙酮、甲醇、乙酸铵、硫酸铵、牛血清蛋白（BSA）等均为国产分析纯。
1．3 仪器与设备
等电聚焦电泳系统（Protein I 12 IEF 美国伯乐公司 美国）；高重复性高通量大型垂直电泳（EttanDALT Twe *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
lve GE-061-TY7119 GE Healthcare 美国）；Image Scanner Ⅲ 扫描仪（28-9076-07 GE Healthcare 美国）；精密电子天平（DJ300 北京赛多利斯仪器系统有限公司 上海）；恒温磁力搅拌器（85-1 常州国华电器有限公司 常州）；高速冷冻离心机（GL-20G-Ⅱ 上海安亭科学仪器厂 上海）；数显恒温水浴锅（HH-6 常州国华电器有限公司 常州）；台面式pH/ISE测试仪（Orion86802 上海纳锘仪器有限公司 美国）；微型旋涡混合仪（XW-80A 上海沪西分析仪器厂有限公司 上海）；紫外-可见分光光度计（WFJ UV-2802 PC 尤尼柯(上海)仪器有限公司 上海）等。
1．4 方法
1．4．1 蛋白质制备方法
1．4．1．1 TCA-丙酮法[16]
称取5 g果肉，加2% (w/w) PVPP[15]用液氮在研钵中将其研磨成粉。然后加入5倍体积-20 ℃预冷的10% (w/v) TCA 内含0.07% (v/v) β-巯基乙醇，匀浆液于-20 ℃下过夜培养。10000×g离心30 min，收集沉淀。沉淀用冷丙酮冲洗3次，4 ℃下干燥后保存于-20 ℃备用。
1．4．1．2 TCA丙酮-SDS法
参照张丽等[17]的方法并稍加改进。称取5 g果肉，加2% (w/w) PVPP用液氮在研钵中研磨成粉。加入10 mL的SDS缓冲液(缓冲液中含有33 mmolL-1 Tris-HCl (pH 7.8)，7.5% (w/v) 蔗糖，5% (v/v) β-巯基乙醇，2% (w/v) SDS)。再以10000×g离心30 min。将上清液转移到新的离心管中，加入终浓度为10% (w/v) 的TCA溶液，-20 ℃下放置2 h，10000×g离心30 min，收集沉淀。用冷丙酮冲洗3次，4 ℃下干燥后保存于-20 ℃备用。
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