鸡骨蛋白酶解物制备多肽及功能性质的研究
目 录
1 引言 1
1.1 生物活性肽种类 1
1.2 鸡骨资源的利用现状 3
1.3 蛋白质酶解技术特点 3
1.4 蛋白质酶解产物特点 3
1.5 酶解技术在畜禽鲜骨架蛋白中的研究进展 4
1.6 本研究的目的意义及主要研究内容 4
2 材料与方法 5
2.1 试验材料 5
2.2 主要试剂 5
2.3 主要仪器和设备 5
2.4 鸡骨材料处理 5
2.5 水解鸡骨泥蛋白酶的筛选 6
2.6 酶解鸡骨蛋白提取多肽的单因素实验 6
2.7 响应面法优化制备鸡骨多肽的酶解工艺 7
2.8 鸡骨多肽抗氧化性的研究 7
2.9 测定指标与方法 8
2.10 数据统计与分析 8
3 结果与分析 8
3.1 水解鸡骨泥蛋白酶的筛选 8
3.2 酶解鸡骨蛋白提取多肽的工艺研究 10
3.3 响应面法优化制备鸡骨多肽的酶解工艺 12
3.4 鸡骨多肽的抗氧化性质 17
结 论 19
致 谢 20
参考文献 21
1 引言
鸡骨中含有丰富的蛋白质、矿物质和人体必需的其它微量元素，以及磷脂、磷蛋白、软骨素、酸性粘多糖和维生素A、B1、B2等多种营养素[1]。
鸡骨中蛋白质90%为胶原蛋白，是较为全价的可溶性蛋白，而且生长期越短的动物，骨胶原含量越丰富。其组成氨基酸种类齐全，包括8种人体所必需的氨基酸，含量高且比例均衡[2]；骨脂肪中亚油 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
酸含量较高，饱和脂肪和不饱和脂肪含量比例接近1:1，组成较为合理，可作为优质食用油[3]；鸡骨骼中矿物质，包括钙、磷、铁、锌、铜等，其中钙磷盐含量很高，且比例接2:1，与人体骨骼中钙磷比例相同，是理想的天然补钙原料。
近年来的中外研究纷纷证实，胶原蛋白与人体衰老和骨质疏松等疾病相关，水解胶原蛋白肽更是具有多种活性，如抗氧化、降血压、补钙、降血糖、促进皮肤胶原代谢等[4~9]。
《本草纲目》和《本草经集注》中就有以脊椎骨髓配药治疗贫血的记载，民间则有“骨髓可以补骨髓，壮筋骨，延年益寿”之说，素有熬骨架汤健骨的习惯[10]。
1.1 生物活性肽种类
生物活性肽是具有特殊生理功能的肽。以前，人们认为氨基酸是人体吸收蛋白质的主要途径。近年来，科学家经研究发现，蛋白质经消化道酶促水解后主要以小肽的形式吸收，比完全游离氨基酸更易、更快被机体吸收利用。这是肽研究理论和实践的重大突破。氨基酸是其基本构成单位，由2个或3个氨基酸脱水缩合而成的肽分别叫二肽和三肽，以此类推为四肽、五肽。一般说来，肽链上氨基酸数目在10个以内的叫寡肽，10-50个的叫多肽，50个以上的叫蛋白质。肽由氨基酸组成，人体存在20种氨基酸，由不同的氨基酸的种类排列，加上数量排列形成，再加上还可能有的二级、三级结构，其种类是十分庞大的。每一种活性肽都具有独特的组成结构，不同活性肽的组成结构决定了其功能。此外活性肽在生物体内的含量是很微量的，但却具有显著的生理活性。
1.1.1 抗菌肽
抗菌活性肽常见于从动物、植物和微生物体内分离或免疫昆虫获得，多数是50个氨基酸以下的碱性或正离子肽，富含赖氨酸和精氨酸。具有亲水性和亲脂性，亲水性使其溶于体液，亲脂性使其与细菌细胞膜结合，使敏感细菌的细胞膜下形成小孔，致使细胞泄漏，导致生长受抑直至死亡。根据结构，抗菌多肽可分为环状肽、糖肽和脂肽三类。
1999年，美国密西西比大学的Hamann研究小组分别从海藻和海洋昆虫分离得到环肽Massetolide A和Viscosin结核杆菌有抗菌效果；Angela于2002年报道了一种新的环十肽Callipeltin A，这个环肽是从Vanuaru群岛附近海域采集到的海绵Callipelta属中分离得到的；2003年韩国的李颂永等人从小龙虾Paxifastacus Ieniusculus的血青素中提取到的一种多肽具有抗菌和抗真菌活性。
1.1.2 抗氧化肽
抗氧化肽存在于动物肌肉中的肌肤，可在体外抑制被铁、血红蛋白、脂质氧化酶和单态氧催化的脂质氧化作用。某些肽和蛋白水解物可起着重金属清道夫作用和过氧化氢分解促进剂的作用，因而可降低自氧化速率和减少脂肪过氧化氢含量。
Joen等研究应用超滤技术对鳍鱼鱼蛋白水解物进行分离纯化获得三个部分的肽片段，实验发现分子量介于3-10Kda的肽片段具有很高的抗氧化活性；林琳等从鱿鱼皮胶原蛋白水解物中提取的多肽，分子量小于2000Da 的组份对超氧自由基和羟基自由基具有良好的清除作用。该活性多肽组分可以提高小鼠血液及皮肤中SOD和GSH-Px的活力，降低 MDA 含量，并能提高小鼠皮肤组织中Hyp的含量[11]；2000年，Kim等人；2004年，Jun，Park等人以及2005年，Rajapakse等通过从鱼蛋白酶解产生的多肽进行实验，发现在不同的抗氧化体系中，存在抗氧化活性。
1.1.3 免疫调节功能肽
免疫调节活性肽对机体具有免疫调节活性，这些肽包括自细胞素免疫活性肽和来源于致病有机物和来源于食物的免疫诱导肽。目前，越来越多的免疫调节活性肽从海产动物中被发现，这些肽除了具有刺激巨噬细胞的吞噬能力外，还能抑制肿瘤细胞的生长。这些免疫活性肽可与肠粘膜结合淋巴组织相互作用，也可自由通过肠壁而直接与外周淋巴细胞发生作用[12-14]。
1996年，Gildberg，Bogwald等人实验发现，从大西洋鳍鱼蛋白酶解物中分离到的酸性多肽，具有非常强的免疫调节作用；2000年，我国学者杜卫等利用RP-HPLC从栉孔扇贝中分离得到四个分子量800-1000Da的小分子多肽，并对其进行了药理活性测试。
1.1.4 降压肽
食物降血压肽的研究开始于Oshima等1979年报道的从明胶酶解液中提取的六条ACE抑制肽。研究表明抑制ACE活性的大部分主要集中在分子量较小的部分。这表明除肽的序列外，肽的分子大小对其活性也是一个影响因素。这是第一次用体外蛋白酶降解得到的由食品蛋白质生产的活性肽。抗高血压肽主要是通过抑制血管紧张素I转换酶，进而影响肾素—血管紧张素-醛固酮系统来实现对血压影响的。
2000年，Choi，Park等人研究发现一些从鱼蛋白酶解产生的多肽，其ACE抑制活性明显大于部分天然肽；2005年，Kim，Kwon等人都发现一些从鱼蛋白酶解产生的多肽通过高血压老鼠体内试验，发现均具有降低血压的效果。
1.2 鸡骨资源的利用现状
我国是世界第一肉类生产大国，2006年我国肉类总产量为8051万吨，但精深加工却只近10%。畜骨约占胴体重的10%~30%，年产鲜骨约1800万吨左右，但其中被深加工的不足2%，造成极大的浪费，而我国的鸡肉产量也一直稳居世界前列。在鸡肉加工过程中，对大量产生的骨架，往往以较低的价格直接销售，或通过骨肉分离机，进一步的获取上面残留的鲜肉，而排出的废渣俗称骨渣，更是价格低廉，例如冷冻鲜鸡骨渣为800元/吨。
1 引言 1
1.1 生物活性肽种类 1
1.2 鸡骨资源的利用现状 3
1.3 蛋白质酶解技术特点 3
1.4 蛋白质酶解产物特点 3
1.5 酶解技术在畜禽鲜骨架蛋白中的研究进展 4
1.6 本研究的目的意义及主要研究内容 4
2 材料与方法 5
2.1 试验材料 5
2.2 主要试剂 5
2.3 主要仪器和设备 5
2.4 鸡骨材料处理 5
2.5 水解鸡骨泥蛋白酶的筛选 6
2.6 酶解鸡骨蛋白提取多肽的单因素实验 6
2.7 响应面法优化制备鸡骨多肽的酶解工艺 7
2.8 鸡骨多肽抗氧化性的研究 7
2.9 测定指标与方法 8
2.10 数据统计与分析 8
3 结果与分析 8
3.1 水解鸡骨泥蛋白酶的筛选 8
3.2 酶解鸡骨蛋白提取多肽的工艺研究 10
3.3 响应面法优化制备鸡骨多肽的酶解工艺 12
3.4 鸡骨多肽的抗氧化性质 17
结 论 19
致 谢 20
参考文献 21
1 引言
鸡骨中含有丰富的蛋白质、矿物质和人体必需的其它微量元素，以及磷脂、磷蛋白、软骨素、酸性粘多糖和维生素A、B1、B2等多种营养素[1]。
鸡骨中蛋白质90%为胶原蛋白，是较为全价的可溶性蛋白，而且生长期越短的动物，骨胶原含量越丰富。其组成氨基酸种类齐全，包括8种人体所必需的氨基酸，含量高且比例均衡[2]；骨脂肪中亚油 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
酸含量较高，饱和脂肪和不饱和脂肪含量比例接近1:1，组成较为合理，可作为优质食用油[3]；鸡骨骼中矿物质，包括钙、磷、铁、锌、铜等，其中钙磷盐含量很高，且比例接2:1，与人体骨骼中钙磷比例相同，是理想的天然补钙原料。
近年来的中外研究纷纷证实，胶原蛋白与人体衰老和骨质疏松等疾病相关，水解胶原蛋白肽更是具有多种活性，如抗氧化、降血压、补钙、降血糖、促进皮肤胶原代谢等[4~9]。
《本草纲目》和《本草经集注》中就有以脊椎骨髓配药治疗贫血的记载，民间则有“骨髓可以补骨髓，壮筋骨，延年益寿”之说，素有熬骨架汤健骨的习惯[10]。
1.1 生物活性肽种类
生物活性肽是具有特殊生理功能的肽。以前，人们认为氨基酸是人体吸收蛋白质的主要途径。近年来，科学家经研究发现，蛋白质经消化道酶促水解后主要以小肽的形式吸收，比完全游离氨基酸更易、更快被机体吸收利用。这是肽研究理论和实践的重大突破。氨基酸是其基本构成单位，由2个或3个氨基酸脱水缩合而成的肽分别叫二肽和三肽，以此类推为四肽、五肽。一般说来，肽链上氨基酸数目在10个以内的叫寡肽，10-50个的叫多肽，50个以上的叫蛋白质。肽由氨基酸组成，人体存在20种氨基酸，由不同的氨基酸的种类排列，加上数量排列形成，再加上还可能有的二级、三级结构，其种类是十分庞大的。每一种活性肽都具有独特的组成结构，不同活性肽的组成结构决定了其功能。此外活性肽在生物体内的含量是很微量的，但却具有显著的生理活性。
1.1.1 抗菌肽
抗菌活性肽常见于从动物、植物和微生物体内分离或免疫昆虫获得，多数是50个氨基酸以下的碱性或正离子肽，富含赖氨酸和精氨酸。具有亲水性和亲脂性，亲水性使其溶于体液，亲脂性使其与细菌细胞膜结合，使敏感细菌的细胞膜下形成小孔，致使细胞泄漏，导致生长受抑直至死亡。根据结构，抗菌多肽可分为环状肽、糖肽和脂肽三类。
1999年，美国密西西比大学的Hamann研究小组分别从海藻和海洋昆虫分离得到环肽Massetolide A和Viscosin结核杆菌有抗菌效果；Angela于2002年报道了一种新的环十肽Callipeltin A，这个环肽是从Vanuaru群岛附近海域采集到的海绵Callipelta属中分离得到的；2003年韩国的李颂永等人从小龙虾Paxifastacus Ieniusculus的血青素中提取到的一种多肽具有抗菌和抗真菌活性。
1.1.2 抗氧化肽
抗氧化肽存在于动物肌肉中的肌肤，可在体外抑制被铁、血红蛋白、脂质氧化酶和单态氧催化的脂质氧化作用。某些肽和蛋白水解物可起着重金属清道夫作用和过氧化氢分解促进剂的作用，因而可降低自氧化速率和减少脂肪过氧化氢含量。
Joen等研究应用超滤技术对鳍鱼鱼蛋白水解物进行分离纯化获得三个部分的肽片段，实验发现分子量介于3-10Kda的肽片段具有很高的抗氧化活性；林琳等从鱿鱼皮胶原蛋白水解物中提取的多肽，分子量小于2000Da 的组份对超氧自由基和羟基自由基具有良好的清除作用。该活性多肽组分可以提高小鼠血液及皮肤中SOD和GSH-Px的活力，降低 MDA 含量，并能提高小鼠皮肤组织中Hyp的含量[11]；2000年，Kim等人；2004年，Jun，Park等人以及2005年，Rajapakse等通过从鱼蛋白酶解产生的多肽进行实验，发现在不同的抗氧化体系中，存在抗氧化活性。
1.1.3 免疫调节功能肽
免疫调节活性肽对机体具有免疫调节活性，这些肽包括自细胞素免疫活性肽和来源于致病有机物和来源于食物的免疫诱导肽。目前，越来越多的免疫调节活性肽从海产动物中被发现，这些肽除了具有刺激巨噬细胞的吞噬能力外，还能抑制肿瘤细胞的生长。这些免疫活性肽可与肠粘膜结合淋巴组织相互作用，也可自由通过肠壁而直接与外周淋巴细胞发生作用[12-14]。
1996年，Gildberg，Bogwald等人实验发现，从大西洋鳍鱼蛋白酶解物中分离到的酸性多肽，具有非常强的免疫调节作用；2000年，我国学者杜卫等利用RP-HPLC从栉孔扇贝中分离得到四个分子量800-1000Da的小分子多肽，并对其进行了药理活性测试。
1.1.4 降压肽
食物降血压肽的研究开始于Oshima等1979年报道的从明胶酶解液中提取的六条ACE抑制肽。研究表明抑制ACE活性的大部分主要集中在分子量较小的部分。这表明除肽的序列外，肽的分子大小对其活性也是一个影响因素。这是第一次用体外蛋白酶降解得到的由食品蛋白质生产的活性肽。抗高血压肽主要是通过抑制血管紧张素I转换酶，进而影响肾素—血管紧张素-醛固酮系统来实现对血压影响的。
2000年，Choi，Park等人研究发现一些从鱼蛋白酶解产生的多肽，其ACE抑制活性明显大于部分天然肽；2005年，Kim，Kwon等人都发现一些从鱼蛋白酶解产生的多肽通过高血压老鼠体内试验，发现均具有降低血压的效果。
1.2 鸡骨资源的利用现状
我国是世界第一肉类生产大国，2006年我国肉类总产量为8051万吨，但精深加工却只近10%。畜骨约占胴体重的10%~30%，年产鲜骨约1800万吨左右，但其中被深加工的不足2%，造成极大的浪费，而我国的鸡肉产量也一直稳居世界前列。在鸡肉加工过程中，对大量产生的骨架，往往以较低的价格直接销售，或通过骨肉分离机，进一步的获取上面残留的鲜肉，而排出的废渣俗称骨渣，更是价格低廉，例如冷冻鲜鸡骨渣为800元/吨。
版权保护: 本文由 hbsrm.com编辑，转载请保留链接: www.hbsrm.com/swgc/spkxygc/439.html
