紫背天葵叶片总rna提取方法的比较与优化
摘要：总RNA的提取是紫背天葵研究中的重要部分，其提取质量将直接影响到后续试验的成败。为筛选出适合紫背天葵叶片总RNA提取方法，本实验以紫背天葵叶片为试材，分别采用CTAB法, 异硫氰酸胍法，SDS法, Trizol法,TAKARA试剂盒法进行总RNA方法的提取实验。对总RNA进行浓度测定、琼脂糖凝胶电泳、紫外检测，检测结果表明：CTAB法提取总RNA条带清晰、亮度高、质量好、纯度高；TAKARA试剂盒法提取总RNA质量接近前者，但存在一定DNA污染；异硫氰酸胍法，SDS法, Trizol法提取RNA均存在不同程度的降解和污染。综合判断，CTAB法是适合紫背天葵叶片总RNA提取一种有效方法。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.1.1实验用具及试剂 2
1.1.2仪器3
1.1.3样品3
1.2实验方案3
1.3实验方法4
1.3.1 CTAB法4
1.3.2异硫氰酸胍法4
1.3.3 SDS法4
1.3.4 Trizol法5
1.3.5 TAKARA试剂盒法5
1.3.6总RNA浓度5
1.3.7总RNA进行1%的琼脂糖凝胶电泳5
1.3.8总RNA进行凝胶成像系统观测5
1.4研究方法5
1.4.1纯度水平5
1.4.2质量水平6
2结果与分析6
2.1不同提取方法对总 RNA 纯度的影响6
2.2不同提取方法对总 RNA 提取质量的电泳分析6
2.2.1 CTAB法7
2.2.2异硫氰酸胍法7
2.2.3 SDS法7
2.2.4 Trizol法8
2.2.5 TAKARA试剂盒法8
3讨论9
致谢9
参考文献10
紫背天葵叶片总RNA提取方法的比较与优化
引言
紫背天
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
葵，学名Gynura bicolor(Roxb.exWilld.)D.C，别名紫背菜、两色三七草、红背菜、观音菜，为菊科三七草属(Gynura)多年生宿根草本植物，原产于中国，在南方多省，如广东、海南、福建、四川等地均有分布和种植[1]。
紫背天葵具有良好的食用及药用价值，据有关研究表明，紫背天葵每100 g干物质中含Ca(1.43.0g)、P(0.170.39 g)、Cu(1.342.52 g)、Fe(20.97 mg)、Zn（2.607.22 mg)、Mn(4.7714.87mg)，鲜叶和嫩梢的维生素 C含量较高，还含有黄酮苷，具有延长维生素C的寿命，减少血管紫癜，提高抗寄生虫和抗病毒的能力，并对肿瘤有一定抗效[2]。药学，具有清热解毒、活血止血、降血压、消肿等功效,主治痛经、血崩、咳血、血气亏、创伤出血、溃疡久不收口等[3]。近二、三十年来，关于紫背天葵的资源、栽培、化学成分、微量元素、营养与保健研究引起国内外学者的注意，做了不少相关研究工作，并取得了一定的进展[4]。但是在紫背天葵基因分子和抗逆分子方面的研究相关报道较少。因此，试验表明,紫背天葵性味甘、凉从分子水平对紫背天葵进行研究具有重要的现实意义。随着现代分子生物学技术的发展，运用分子生物学技术对紫背天葵进行基因克隆及用于活性物质功能研究的cDNA文库构建等分子方面的研究，已成为其当前研究的迫切需要。这一实验过程的重要基础就是核酸的提取，特别是总RNA的提取，其提取质量将直接影响到后续试验的成败。
RNA全名核糖核酸，是存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体，是由核糖核苷酸经磷酯键缩合而成的长链状分子。一个核糖核苷酸分子由磷酸，核糖和碱基构成，碱基主要有4种，即A（腺嘌呤）、G（鸟嘌呤）、C（胞嘧啶）、U（尿嘧啶）。主要由mRNA、tRNA、rRNA等组成。在总RNA中，7585%为rRNA（主要是28S26S/23S和18S/16S rRNA），其余的由分子量大小和核苷酸序列各不相同的mRNA和小分子RNA如tRNA、snRNA及snoRNA等组成[5]。
为了获得高质量的RNA，必须要控制RNA酶的活性，也就是要避免RNA酶的污染。RNA酶很稳定，而且反应不需要辅助因子，因而在RNA的制备过程中只要存在少量的RNA酶就会导致实验的失败。为避免RNA酶的污染，实验中所用到的全部溶液、玻璃器皿、塑料制品等都需要特别处理[6]。
植物类与其他生物(动物、微生物)在生物结构和化学组成方面有很大的不同，不同植物同一植物不同组织的RNA提取方法不尽相同。紫背天葵叶片含有大量的次生代谢物，尤其是多糖和多酚类物质，这些生物分子极大地影响RNA提取的产量和质量。总RNA提取质量和产量，对于RNA的RT－PCR，体外酶切等后续的分子生物学研究操作也有很大的影响。目前植物RNA提取的常用方法主要有商业试剂盒如Trizol 法等，不少实验室利用阳离子去污剂CTAB法，阴离子去污剂SDS法，利用异硫氰酸胍变性的异硫氰酸胍法等方法，自行摸索特定植物RNA的提取方法[7]。本实验将采用Trizol 法，异硫氰酸胍法，CTAB法，SDS法、TAKARA试剂盒法提取紫背天葵叶片总RNA，通过RNA提取的质量与产量，分析其优点与不足，探讨其优化改良的方面。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 实验器材及试剂
Trizol试剂、RNA marker、试剂盒购大连TAKARA生物技术公司，其余试剂均为国产分析纯
试验中使用的各种器皿和耗材如研钵、枪头、离心管等均洗净后用0.1 % DEPC溶液浸泡12 h以上，121℃灭菌15 min并烘干（灭菌后上述物品打开后仅用一次，避免染菌）。电泳槽及所用梳子和挡板用0.1% DEPC水处理12 h以上，并用保鲜膜封好。各种RNA操作参照《分子克隆实验指南》[6]进行
将氯仿/异戊醇（24:1）、氯仿、异戊醇、无水乙醇、75%乙醇放入20℃冰箱中冷藏备用。
CTAB提取液：2%CTAB，2%PVP，25mM EDTA，100mM Triscl pH8.0，1.0M Nacl，0.5g/L，2%β巯基乙醇（用前加）；
SDS提取液：0.1 mol/L Tris－HCl ( pH值7.4), 0.5 mol/L NaCl， 25 mmol/L EDTA (pH值8.0),20 g/L SDS(20 g/L PVPP和20 g/L β－巯基乙醇使用前加入)；
异硫氰酸胍提取液：4 mL的4 mol/L异硫氰酸胍，150μL β－巯基乙醇；
SSTE buffer溶液：0.5%SDS，1mol/L Nacl，0.1 mol/L Tris HCl(pH值8.0)，1mmol/L EDTA；
电泳缓冲液：DEPC处理水，10%TAE缓冲液（体积比9:1）
10%TAE缓冲液：48.4gTris碱，11.4mL冰醋酸，20mL 0.5mol/L EDTA溶液，溶解定容至1000mL。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.1.1实验用具及试剂 2
1.1.2仪器3
1.1.3样品3
1.2实验方案3
1.3实验方法4
1.3.1 CTAB法4
1.3.2异硫氰酸胍法4
1.3.3 SDS法4
1.3.4 Trizol法5
1.3.5 TAKARA试剂盒法5
1.3.6总RNA浓度5
1.3.7总RNA进行1%的琼脂糖凝胶电泳5
1.3.8总RNA进行凝胶成像系统观测5
1.4研究方法5
1.4.1纯度水平5
1.4.2质量水平6
2结果与分析6
2.1不同提取方法对总 RNA 纯度的影响6
2.2不同提取方法对总 RNA 提取质量的电泳分析6
2.2.1 CTAB法7
2.2.2异硫氰酸胍法7
2.2.3 SDS法7
2.2.4 Trizol法8
2.2.5 TAKARA试剂盒法8
3讨论9
致谢9
参考文献10
紫背天葵叶片总RNA提取方法的比较与优化
引言
紫背天
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
葵，学名Gynura bicolor(Roxb.exWilld.)D.C，别名紫背菜、两色三七草、红背菜、观音菜，为菊科三七草属(Gynura)多年生宿根草本植物，原产于中国，在南方多省，如广东、海南、福建、四川等地均有分布和种植[1]。
紫背天葵具有良好的食用及药用价值，据有关研究表明，紫背天葵每100 g干物质中含Ca(1.43.0g)、P(0.170.39 g)、Cu(1.342.52 g)、Fe(20.97 mg)、Zn（2.607.22 mg)、Mn(4.7714.87mg)，鲜叶和嫩梢的维生素 C含量较高，还含有黄酮苷，具有延长维生素C的寿命，减少血管紫癜，提高抗寄生虫和抗病毒的能力，并对肿瘤有一定抗效[2]。药学，具有清热解毒、活血止血、降血压、消肿等功效,主治痛经、血崩、咳血、血气亏、创伤出血、溃疡久不收口等[3]。近二、三十年来，关于紫背天葵的资源、栽培、化学成分、微量元素、营养与保健研究引起国内外学者的注意，做了不少相关研究工作，并取得了一定的进展[4]。但是在紫背天葵基因分子和抗逆分子方面的研究相关报道较少。因此，试验表明,紫背天葵性味甘、凉从分子水平对紫背天葵进行研究具有重要的现实意义。随着现代分子生物学技术的发展，运用分子生物学技术对紫背天葵进行基因克隆及用于活性物质功能研究的cDNA文库构建等分子方面的研究，已成为其当前研究的迫切需要。这一实验过程的重要基础就是核酸的提取，特别是总RNA的提取，其提取质量将直接影响到后续试验的成败。
RNA全名核糖核酸，是存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体，是由核糖核苷酸经磷酯键缩合而成的长链状分子。一个核糖核苷酸分子由磷酸，核糖和碱基构成，碱基主要有4种，即A（腺嘌呤）、G（鸟嘌呤）、C（胞嘧啶）、U（尿嘧啶）。主要由mRNA、tRNA、rRNA等组成。在总RNA中，7585%为rRNA（主要是28S26S/23S和18S/16S rRNA），其余的由分子量大小和核苷酸序列各不相同的mRNA和小分子RNA如tRNA、snRNA及snoRNA等组成[5]。
为了获得高质量的RNA，必须要控制RNA酶的活性，也就是要避免RNA酶的污染。RNA酶很稳定，而且反应不需要辅助因子，因而在RNA的制备过程中只要存在少量的RNA酶就会导致实验的失败。为避免RNA酶的污染，实验中所用到的全部溶液、玻璃器皿、塑料制品等都需要特别处理[6]。
植物类与其他生物(动物、微生物)在生物结构和化学组成方面有很大的不同，不同植物同一植物不同组织的RNA提取方法不尽相同。紫背天葵叶片含有大量的次生代谢物，尤其是多糖和多酚类物质，这些生物分子极大地影响RNA提取的产量和质量。总RNA提取质量和产量，对于RNA的RT－PCR，体外酶切等后续的分子生物学研究操作也有很大的影响。目前植物RNA提取的常用方法主要有商业试剂盒如Trizol 法等，不少实验室利用阳离子去污剂CTAB法，阴离子去污剂SDS法，利用异硫氰酸胍变性的异硫氰酸胍法等方法，自行摸索特定植物RNA的提取方法[7]。本实验将采用Trizol 法，异硫氰酸胍法，CTAB法，SDS法、TAKARA试剂盒法提取紫背天葵叶片总RNA，通过RNA提取的质量与产量，分析其优点与不足，探讨其优化改良的方面。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 实验器材及试剂
Trizol试剂、RNA marker、试剂盒购大连TAKARA生物技术公司，其余试剂均为国产分析纯
试验中使用的各种器皿和耗材如研钵、枪头、离心管等均洗净后用0.1 % DEPC溶液浸泡12 h以上，121℃灭菌15 min并烘干（灭菌后上述物品打开后仅用一次，避免染菌）。电泳槽及所用梳子和挡板用0.1% DEPC水处理12 h以上，并用保鲜膜封好。各种RNA操作参照《分子克隆实验指南》[6]进行
将氯仿/异戊醇（24:1）、氯仿、异戊醇、无水乙醇、75%乙醇放入20℃冰箱中冷藏备用。
CTAB提取液：2%CTAB，2%PVP，25mM EDTA，100mM Triscl pH8.0，1.0M Nacl，0.5g/L，2%β巯基乙醇（用前加）；
SDS提取液：0.1 mol/L Tris－HCl ( pH值7.4), 0.5 mol/L NaCl， 25 mmol/L EDTA (pH值8.0),20 g/L SDS(20 g/L PVPP和20 g/L β－巯基乙醇使用前加入)；
异硫氰酸胍提取液：4 mL的4 mol/L异硫氰酸胍，150μL β－巯基乙醇；
SSTE buffer溶液：0.5%SDS，1mol/L Nacl，0.1 mol/L Tris HCl(pH值8.0)，1mmol/L EDTA；
电泳缓冲液：DEPC处理水，10%TAE缓冲液（体积比9:1）
10%TAE缓冲液：48.4gTris碱，11.4mL冰醋酸，20mL 0.5mol/L EDTA溶液，溶解定容至1000mL。
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