大豆膳食纤维改性技术研究
摘要：大豆膳食纤维的改性有物理方法、化学方法和生物方法。本文采用生物方法，研究了几种常见食用菌液态发酵豆渣制备可溶性膳食纤维(SDF)过程中的酶学特性。通过纤维素酶活性测定、发酵过程中营养成分变化以及发酵后可溶性膳食纤维的含量，对几种食用菌改性不溶性膳食纤维的特性进行考察。结果表明，在发酵过程中，五种食用菌的酶学特性具有显著差异。其中，平菇因具有较高的C1酶活性和较低的C?酶及βG酶活性，使得发酵后培养基中可溶性膳食纤维含量达到20.49%，显著高于其他四种食用菌，是原料中可溶性膳食纤维含量的4.39倍。关键词 食用菌，液态发酵，豆渣，可溶性膳食纤维，酶学关键词Research on modification of soybean dietary fiberFood Science and Technology Yang MengjiaTutor Yang RunqiangAbstract: The enzymology of different edible fungis during preparation of soluble dietary fibre from soybean okara by liquid state fermentation was studied. There are statistically significant differences in enzymology between different edible fungis. Pleurotus ostreatus increased the content of SDF to 20.49%, which is 4.39 times higher than soybean okara, because of its higher activity of exo-1,4-β-D-glucanase, lower activity of endo-1,4-β-D-glucanase and β-1, 4-D-glucosidase. It shows significant difference from the other four kinds of edible fungi.AbstractKey words豆渣是大豆在加工制作豆腐、豆浆等豆制品的副产物，其干物质重约
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占全豆质量的16%～25%[1]，我国每年大豆行业会产生2000万吨湿豆渣[2]，豆渣中含有丰富的营养成分，包括膳食纤维、蛋白质、脂肪、维生素及黄酮物质。豆渣中膳食纤维(Dietary fibre,DF)含量为50~55%，其中可溶性膳食纤维(Soluble dietary fibre,SDF)含量在6%左右[3]。DF对人体健康具有积极的促进作用[4]，包括促进肠道蠕动、增加排便、降低血液胆固醇和调节血糖等作用[5, 6]。尤其是SDF具有比IDF更好的生理活性和理化性质。我国是食用真菌种植和食用大国，被广泛种植的菌种有平菇、香菇、双孢菇、木耳和金针菇等[7]。关于以上数种菌菇的栽培技术及其生物学特性已有大量报道，而从酶学性质上探讨并不多见。食用真菌在生长过程中会生产复杂的纤维素酶系，其中包括内切葡聚糖酶（纤维素C?酶）、外切葡聚糖酶（纤维素C1酶）和β-葡萄糖苷酶（βG酶）。在以上三种纤维素酶的协调作用下，逐步将不溶性膳食纤维水解成为可溶性膳食纤维和纤维二糖，最终水解成单糖。目前关于纤维素酶各组分之间协同作用主要有两种观点：一种观点认为，首先由C?酶在纤维素分子内部的无定形区进行酶切产生新的末端，然后由C1酶以纤维二糖为单位由末端进行水解，每次切下1个纤维二糖分子，最后由βG酶将纤维二糖以及短链的纤维寡糖水解为葡萄糖。另一种观点则认为，首先是由C1酶水解不溶性纤维素生成可溶性的纤维糊精和纤维二糖，然后由C?酶作用于纤维糊精生成纤维二糖，再由βG酶将纤维二糖分解成2个葡萄糖。这种协同作用方式也决定了纤维素酶表达调控的复杂性。本文利用五种常见食用菌对豆渣进行发酵试验，探讨发酵过程中与纤维素水解相关的五种关键酶活性变化、发酵液主要成分变化以及发酵后膳食纤维含量变化，旨在为豆渣发酵利用寻找更佳途径。1 材料与方法 1.1材料与仪器1.1.1菌种杏鲍菇(Pleurotus eryngii)、平菇(Pleurotus ostreatus)、香菇(Lentinus edodes)、珍珠菇(Flammulina velutiper)、秀珍菇(Pleurotus geesteranus)均购自江苏省高淳区农林局食用菌研究所。1.1.2原料豆渣由江苏省苏州市金记食品有限公司提供。鲜豆渣于50°C烘干后打粉：水分含量7.17%，粗蛋白含量17.28%，粗脂肪含量6.72%，淀粉含量2.63%，不溶性膳食纤维(IDF)含量45.50%，可溶性膳食纤维(SDF)含量4.67%。1.1.3培养基斜面及平板培养基：采用PDA培养基（马铃薯20%，葡萄糖2%，琼脂1.5%，自然pH）；种子培养基：采用PD液体培养液(马铃薯20%，葡萄糖2%，自然pH)；豆渣培养基（发酵培养基）：豆渣处理液，自然pH。豆渣处理液制备工艺：新鲜豆渣挤去大部分水后于50 °C烘干打粉。加水配置30g/L的料液，料液经胶体磨匀浆处理5 min即为豆渣处理液。菌株生长速度比较培养基：PDA平板固体培养基；菌株发酵豆渣培养基添加1.5%琼脂，灌注于平皿。采用湿热灭菌法，置于121°C灭菌20 min。1.2 实验方法1.2.1生长速度游标卡尺测定。1.2.2 发酵种子液的制备将菌种接种至装有PDA培养基平板中央，于25°C培养12 d；用直径8 mm打孔器取4片菌丝体接种于装有50 mL PD培养基的250 mL三角瓶中，于25°C，摇床转速120 r/min条件下培养8 d，培养液在无菌条件下匀浆处理即得发酵种子液。1.2.3液态发酵将发酵种子液以10%(v/v)的接种量接种至装有50 mL豆渣培养基的250 mL三角瓶中，于25°C，摇床转速80 r/min条件下发酵8 d，各菌种均设3个重复。1.2.4酶活性测定粗酶液制备：发酵液于冷冻离心机中，在0~4°C、10 000 rpm离心15 min，上清液即为粗酶液。淀粉酶活性：在Kunamneni等[8]的方法上加以调整。取1 mL粗酶液添加至1mL 1%(w/v)的可溶性淀粉（由0.1 M pH 6.0醋酸钠缓冲溶液溶解）中，于50°C保温1 h，反应结束后，采用加热法终止酶反应(100°C，10 min)。用DNS法测定反应液中还原糖含量，以灭活粗酶液添加1 mL 1%可溶性淀粉为对照；淀粉酶活定义：1 mL粗酶液单位时间(1 min)在50°C水解可溶性淀粉产生1μmol葡萄糖定义为1个酶活单位(U/mL)。蛋白酶活性：在Wang等[9]的方法上加以调整。取0.5 mL粗酶液添加至0.5 mL的酪蛋白溶液中（酪蛋白用0.1 M的氢氧化钠溶液溶解，0.2 M pH为7的磷酸缓冲液定容），于37°C保持1 h，反应结束后，采用加热法终止酶反应(100°C，10 min)；用茚三酮比色法测定水解液中氨基态氮的含量，以灭活粗酶液添加1 mL 1.5%的酪蛋白溶液为对照；酶活定义：1 mL的粗酶液单位时间(1 min)在37°C水解酪蛋白产生1 μmol氨基态氮定义为1个酶活单位(U/mL)。纤维素C1酶活性：在Martins等[10] 的方法上加以调整。取50 mg干燥脱脂棉，剪碎后加入2.0 mL pH 5.0的0.1 M的柠檬酸缓冲液，加热至50°C；添加0.5 mL粗酶液于混合物中，于50°C水浴保持2 h，采用加热法终止酶反应(100°C，10 min)，冷却后用DNS比色法测定酶解液中还原糖增加量，以灭活粗酶液为对照；酶活定义：1 mL粗酶液单位时间(1 min)内50°C水解滤纸产生1μmol葡萄糖定义为1个酶活单位(U/mL)。纤维素C?酶活性：取酶液0.5 mL 加入2 mL质量分数为0.5%的羧甲基纤维素钠溶液（pH 5.0的0.1 M的柠檬酸缓冲液溶解）于65°C酶解30 min，后续步骤同C1酶活性测定，酶活力单位同C1酶的酶活力单位。纤维素βG酶活测定：取酶液0.5 mL 加入2 mL质量分数为0.5%的水杨素溶液(pH 5.0的0.1 M的柠檬酸缓冲液溶解)于65°C 酶解30 min，后续步骤同C1酶活性测定，酶活力单位同C1酶的酶活力单位。1.2.5膳食纤维豆渣原料直接取样，发酵样品于10 000 rpm离心后获得发酵上清液和发酵残渣，其中可溶性膳食纤维(SDF)由上清液中SDF和发酵残渣SDF中组成。固体样品及液体样品中可溶性膳食纤维(SDF)：参照谢碧霞等[11]方法；不溶性膳食纤维(IDF)：参照谢碧霞等[11]方法；以上均以干基计。总膳食纤维(TDF)=IDF+SDF。1.2.6其他指标测定水分含量：采用恒重法测定；淀粉含量：采用碘淀粉比色法测定；还原糖含量：采用3,5-二硝基水杨酸法测定；粗蛋白含量：采用微量凯氏定氮法测定；粗脂肪含量：采用索氏抽提法测定；灰分：采用GB 5009.4-2003总灰分测定方法；pH值：采用pH测试仪测定。1.3数据统计与分析实验设3次重复，采用SAS 9.2及SPSS 12.5统计软件进行分析。结果数据用均数±标准差(x±s)表示，不同组之间差异性采用one-way ANOVA方法进行比较，P<0.05表示差异显著具有统计学意义。2结果与分析2.1豆渣中主要成分如表2-1所示，豆渣中含量最高的是IDF，其次是蛋白质和脂肪，矿物元素（灰分含量3.25%）含量同样较丰富。研究表明豆渣中营养成分均衡，其碳源、氮源和矿质元素适宜微生物生长[12]。表2-1 豆渣主要化学成分含量（g/100g DW）成分水分淀粉粗蛋白质粗脂肪灰分IDFSDF含量7.17±0.092.63±0.1217.28±0.176.72±0.113.25±0.1345.50±0.504.67±0.132.2菌体生长速度表2-2 菌株在不同培养基中的生长速度菌种生长速度(mm·d-1)PDA培养基豆渣培养基杏鲍菇3.77±0.29d6.07±0.79b平菇9.48±0.59a9.41±0.02a香菇2.77±0.52c3.51±0.53d珍珠菇2.94±0.23c4.69±0.21c秀珍菇8.41±0.18b6.52±0.28b由表2-2可知，杏鲍菇、平菇、香菇、珍珠菇和秀珍菇在豆渣培养基中生长良好。其中，杏鲍菇、香菇和珍珠菇在豆渣培养基中的生长速度大于PDA培养基中；平菇在豆渣培养基中生长速度与PDA培养基中十分接近；而秀珍菇在豆渣培养基中生长速度小于PDA培养基中。由此可见，豆渣适合于大多数食用菌的生长，原因是豆渣中含有丰富的微生物生长所必需的碳源、氮源、微量元素和生长因子等。2.3发酵过程中酶活性变化2.3.1淀粉酶活性表2-3 发酵过程中食用菌淀粉酶活性菌种淀粉酶活性(mU·mL-1)2 d4 d6 d8 d杏鲍菇109.30±10.36a24.47±3.45d39.26±2.12d22.00±1.89e平菇60.97±4.44d62.45±4.93b141.37±5.42a84.81±3.15c香菇38.28±4.15c44.69±4.94c59.49±3.01c140.00±0.49a珍珠菇29.89±1.48c91.55±5.16a56.53±2.95c126.00±3.38b秀珍菇63.02±1.95b57.65±3.94b100.64±0.49b74.75±5.86d由表2-3所知，菌体在利用豆渣培养基发酵过程中体现出不同的淀粉酶活性特征。其中杏鲍菇和秀珍菇发酵生成淀粉酶活性最低，其最高点分别出现在发酵前期和发酵后期；平菇、香菇和珍珠菇在发酵过程中淀粉酶活性较高，又以平菇和香菇最高，分别于第6 d和8 d时达到141.37 mU/mL和140.00 mU/mL，两菌生产淀粉酶活性随发酵时间的延长而升高，其酶活最高点皆出现在发酵中后期。淀粉被水解生成单糖、二糖、三糖和短链糊精等被菌体利用。本研究旨在利用菌体发酵中产生的酶水解DF以外物质，以提高DF的产量和品质，因此，平菇、香菇和珍珠菇较适宜水解并利用豆渣中的淀粉。2.3.2蛋白酶活性表2-4 发酵过程中食用菌蛋白酶活性菌种蛋白酶活性(mU·mL-1)2 d4 d6 d8d杏鲍菇0.74±0.05d1.50±0.09c1.45±0.09b2.29±0.24a平菇1.85±0.11b1.84±0.13b1.15±0.08b1.38±0.12c香菇1.61±0.08c2.98±0.13a2.13±0.35a1.30±0.14c珍珠菇2.18±0.21a1.35±0.09c1.89±0.12a1.90±0.17b秀珍菇0.00±0.00e1.95±0.11b1.87±0.13a1.87±0.05b如表2-4所示，五种食用菌菌丝体在以豆渣为培养基生长时，生成的蛋白酶活性显著不同。其中以香菇生产蛋白酶能力为最强，第4 d达到最大值2.98 mU/mL；其次为杏鲍菇和珍珠菇，分别于第8 d和第2 d达到2.29和2.18 mU；平菇和秀珍菇蛋白酶活性相对较低，其中平菇在发酵前期蛋白酶活性较高，而秀珍菇在发酵中后期蛋白酶活性较高，并保持相对稳定的状态。五种食用菌都具有分解豆渣中蛋白质并将其归为己用的能力。2.3.3纤维素C1酶活性表2-5 发酵过程中食用菌纤维素C1酶活性菌种纤维素C1酶活性(mU·mL-1)2 d4 d6 d8d杏鲍菇19.46±0.48c23.90±1.18c31.67±2.58b13.54±1.55b平菇23.16±0.74b31.54±1.58a37.71±3.05a5.77±1.11c香菇20.69±0.81c26.86±1.24b10.58±0.85e3.42±0.34c珍珠菇27.10±2.12a13.54±0.87e14.77±1.01d5.37±1.24c秀珍菇10.26±0.31d20.35±0.30d23.29±2.28c18.40±1.57a由表2-5可知，五种食用真菌生成纤维素C1酶的情况显著不同，并且C1酶活性峰值出现时间也大不相同。珍珠菇生成C1酶活性最大值出现在第2 d，随后逐渐下降；香菇生成C1酶在发酵第4 d出现最大值，随后逐渐下降；杏鲍菇、平菇及秀珍菇生成C1酶活性随发酵时间逐渐升高，在第6 d达到最大，随后呈下降趋势；其中，平菇在第2、4、6 d的C1酶活性均高于其他四种食用真菌（发酵第2 d的珍珠菇除外），第6 d达到最大值37.71 mU/mL；杏鲍菇生成C1酶活性次之；以秀珍菇生成C1酶活性为最弱。纤维素C1酶又被称为外切葡聚糖酶，可将不溶性膳食纤维水解成为可溶的纤维糊精及纤维二糖，而后可溶性纤维糊精由C?酶进一步成为纤维二糖，所以较高的C1酶活性有助于膳食纤维的改性。2.3.4纤维素C?酶活性表2-6 发酵过程中食用菌纤维素C?酶活性菌种纤维素C?酶活性(mU·mL-1)2 d4 d6 d8 d杏鲍菇117.79±6.12a144.42±4.74a216.93±5.64a154.78±5.16a平菇98.55±1.24b122.23±3.55b160.70±9.45b142.78±3.15a香菇91.65±3.04c117.29±3.14b79.31±2.54c91.85±4.67b珍珠菇101.51±2.97b110.39±2.41c39.36±3.59d41.04±3.78d秀珍菇11.07±1.02d81.43±3.39d82.73±4.05c76.26±15.63c纤维素C?酶也被成为内切葡聚糖酶，主要作用于纤维素的末端，随机水解纤维素生成纤维二糖。五种食用真菌生成纤维素C?酶的情况显著不同，如表2-6。香菇、珍珠菇和秀珍菇生成纤维素C?酶活性较低，其中秀珍菇最低，始终低于82.73 mU/mL；杏鲍菇和平菇生成纤维素C?酶活性较高，又以杏鲍菇最好，其酶活最高可达216.93 mU/mL，其次是平菇，最高值为160.70 mU/mL，两种菌的纤维素C?酶均随发酵时间的延长而升高，发酵后期逐渐下降。纤维素C?酶的水解产物纤维素会使纤维素产量下降，因此较低的纤维素C?酶活性有助于提高纤维素的产量。2.3.5纤维素βG酶活性表2-7 发酵过程中食用菌纤维素βG酶活性菌种纤维素βG酶活性(mU·mL-1)2 d4 d6 d8d杏鲍菇94.11±3.55b95.59±9.84c139.98±9.47c98.55±4.66a平菇100.52±1.58b110.39±4.47b120.75±1.48c64.52±6.87c香菇74.88±3.98c100.03±3.25bc211.01±10.51b84.03±3.14b珍珠菇113.35±5.42a212.49±6.67a245.05±16.28a70.35±8.23c秀珍菇51.46±12.02d82.73±5.21d97.06±13.03d84.03±7.82b纤维素βG酶又被称为β-葡萄糖苷酶，其主要作用是将纤维二糖水解成为葡萄糖。五种食用真菌生成纤维素βG酶的活性具有显著差别，但各食用真菌的纤维素βG酶随发酵时间延长的变化趋势极其相似，见表2-7。香菇和珍珠菇的纤维素βG酶较高，又以珍珠菇最高，其酶活性最高达245.05 mU/mL，其次为香菇，为211.01 mU/mL；杏鲍菇、平菇和秀珍菇纤维素βG酶活性较低，其中以秀珍菇为最低，发酵期间始终低于100 mU/mL。纤维素βG酶能够消耗纤维素C?酶水解纤维素生成的纤维二糖，对纤维素C?酶的水解反作用具有促进作用，因此，较低的纤维素βG酶活性有利于提高纤维素的产量。2.4发酵过程中主要成分变化2.4.1可溶性蛋白含量变化图2-1 发酵过程中可溶性蛋白含量变化大豆中蛋白质含量高达35%，加工后的豆渣中蛋白质含量仍高达17.28%（表2-1），其中部分为可溶性蛋白。在食用真菌生成的蛋白酶作用下，蛋白质被水解为多肽、氨基酸等供菌体生长利用。五种食用真菌在发酵过程中培养基中可溶性蛋白质含量变化存在显著差异。香菇及珍珠菇对可溶性蛋白质利用能力最强，经发酵后培养基中可溶性蛋白含量最低；杏鲍菇和平菇次之；秀珍菇最弱。蛋白质作为主要氮源被真菌利用有利于菌丝体生长，并且较大程度水解蛋白质有利于提高膳食纤维品质。2.4.2游离氨基酸含量变化图2-2 发酵过程中游离氨基酸含量变化培养基中的游离氨基酸来源于豆渣及食用真菌水解产物，处于水解生成和被微生物利用的动态变化见图2-2。发酵初期，在菌体蛋白酶作用下氨基酸开始生成，含量增加；随着菌体快速生长，利用掉大部分所生产的氨基酸，氨基酸含量趋于平缓；其中，以第4 d平菇游离氨基酸含量最高，香菇最低；发酵结束后，游离氨基酸含量由高至低依次为：平菇、秀珍菇和珍珠菇、香菇及杏鲍菇。2.4.3还原糖含量变化图2-3 发酵过程中还原糖含量变化培养基中的还原糖大部分来源于豆渣中纤维素水解产生，与游离氨基酸一样处于水解生成和被微生物利用的动态变化，见图2-3。随着菌丝体的生长还原糖开始生成，其中，珍珠菇在发酵第2-6 d水解生成大量还原糖，第6 d达到最大值；香菇、平菇和杏鲍菇发酵全程呈现缓慢增加趋势；秀珍菇在发酵初期还原糖增加，第2 d后开始下降并趋于平缓；发酵结束后，还原糖含量由高至低依次为：珍珠菇、香菇、平菇、杏鲍菇和秀珍菇。2.5发酵后膳食纤维含量表2-3 发酵后膳食纤维含量菌种膳食纤维含量(%)IDFSDF杏鲍菇35.56±0.77a9.62±0.51d平菇33.24±2.51a20.49±0.38a香菇14.42±3.11c13.56±1.05b珍珠菇26.31±1.42b11.8±0.51c秀珍菇37.56±2.22a12.96±0.75bc如表2-3所示，经食用菌发酵后的豆渣培养基中膳食纤维含量发生显著变化。其中IDF含量经发酵后都显著低于未发酵样品（IDF含量为45.50%，见表2-1），SDF含量都显著高于未发酵样品（SDF含量为4.67%，见表2-1），其中，以平菇发酵后培养基中SDF含量为最高，为原料中的4.39倍。原因是在食用菌生长过程中会生成复杂的纤维素酶系（纤维素C1酶、Cx酶、βG酶等），在以上酶的作用下，IDF被分解利用，生成单糖、寡糖等小分子糖类供菌体生长所需，在该过程中SDF含量有所增加；并且单糖等小分子糖类被微生物利用后同样会生产菌丝体内的多糖，进一步提高了SDF含量。2.6相关性分析表2-9 膳食纤维与纤维素C1酶、C?酶及βG酶的相关性分析C1酶C?酶βG酶TDF0.220-0.143-0.268IDF-0.480-0.116-0.239SDF0.663-0.097-0.129如表2-9所示，膳食纤维与各食用真菌生成的纤维素C1酶、C?酶及βG酶具有一定的相关性。其中，豆渣经食用真菌发酵后的IDF含量与各菌生成纤维素C1酶呈负相关，相关系数为-0.480；SDF含量与纤维素C1酶呈正相关，相关系数为0.663；另外，IDF、SDF及TDF含量与纤维素C?酶、βG酶活性皆呈现负相关。3结论试验中所采用的五种食用真菌对IDF都具有一定的水解改性能力，在经过发酵后，SDF含量均得到提高。其中，以平菇发酵后SDF产量为最高，达到20.49%，提高了4.39倍，这与发酵过程中较高的C1酶活性和较低的C?酶及βG酶活性具有密切关系，这一结果表明平菇相比其他四种食用真菌具有更好的IDF改性效果；其次为香菇及秀珍菇，SDF分别提高2.90倍和2.78倍。4 致谢感谢顾振新教授，在本论文完成的后期给予了大量有力的指导，使其更加充实详尽。 这里我也要特别感谢师兄赵哲，在毕业实验期间他倾尽所学知识帮助我,指点我，从最基本的实验操作方法到后期数据处理,从论文的写作方法到排版技巧,无一不是在赵哲学长指点下完成的，从中我学到了许多非常实用的知识，真心感谢赵哲学长！参考文献[1] 吴占威, 胡志和. 大豆豆渣的生理功能及其在食品中的应用 [J]. 食品科学, 2012, 33 (19): 358-362.[2] 张振山, 叶素萍, 李泉, 等. 豆渣的处理与加工利用 [J]. 食品科学, 2004, 25 (10): 400-406.[3] 肖少香. 豆渣产品研发综述 [J]. 粮食科技与经济, 2006, (06): 45-48.[4] Riaz, M. 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目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1.1材料与仪器 2
1.1.1菌种 2
1.1.2原料 2
1.1.3培养基 2
1.2 实验方法 2
1.2.1生长速度 2
1.2.2 发酵种子液的制备 2
1.2.3液态发酵 2
1.2.4酶活性测定 2
1.2.5膳食纤维 3
1.2.6其他指标测定 3
1.3数据统计与分析 3
2结果与分析 3
2.1豆渣中主要成分 3
2.2菌体生长速度 4
2.3发酵过程中酶活性变化 4
2.3.1淀粉酶活性 4
2.3.2蛋白酶活性 4
2.3.3纤维素C1酶活性 5
2.3.4纤维素C?酶活性 5
2.4发酵过程中主要成分变化 6
2.4.1可溶性蛋白含量变化 6
2.4.2游离氨基酸含量变化 6
2.4.3还原糖含量变化 7
2.5发酵后膳食纤维含量 7
2.6相关性分析 7
3结论 8
4 致谢 8
参考文献 8
大豆膳食纤维改性技术研究
食品科学与工程 杨孟伽
引言
引言
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占全豆质量的16%～25%[1]，我国每年大豆行业会产生2000万吨湿豆渣[2]，豆渣中含有丰富的营养成分，包括膳食纤维、蛋白质、脂肪、维生素及黄酮物质。豆渣中膳食纤维(Dietary fibre,DF)含量为50~55%，其中可溶性膳食纤维(Soluble dietary fibre,SDF)含量在6%左右[3]。DF对人体健康具有积极的促进作用[4]，包括促进肠道蠕动、增加排便、降低血液胆固醇和调节血糖等作用[5, 6]。尤其是SDF具有比IDF更好的生理活性和理化性质。我国是食用真菌种植和食用大国，被广泛种植的菌种有平菇、香菇、双孢菇、木耳和金针菇等[7]。关于以上数种菌菇的栽培技术及其生物学特性已有大量报道，而从酶学性质上探讨并不多见。食用真菌在生长过程中会生产复杂的纤维素酶系，其中包括内切葡聚糖酶（纤维素C?酶）、外切葡聚糖酶（纤维素C1酶）和β-葡萄糖苷酶（βG酶）。在以上三种纤维素酶的协调作用下，逐步将不溶性膳食纤维水解成为可溶性膳食纤维和纤维二糖，最终水解成单糖。目前关于纤维素酶各组分之间协同作用主要有两种观点：一种观点认为，首先由C?酶在纤维素分子内部的无定形区进行酶切产生新的末端，然后由C1酶以纤维二糖为单位由末端进行水解，每次切下1个纤维二糖分子，最后由βG酶将纤维二糖以及短链的纤维寡糖水解为葡萄糖。另一种观点则认为，首先是由C1酶水解不溶性纤维素生成可溶性的纤维糊精和纤维二糖，然后由C?酶作用于纤维糊精生成纤维二糖，再由βG酶将纤维二糖分解成2个葡萄糖。这种协同作用方式也决定了纤维素酶表达调控的复杂性。本文利用五种常见食用菌对豆渣进行发酵试验，探讨发酵过程中与纤维素水解相关的五种关键酶活性变化、发酵液主要成分变化以及发酵后膳食纤维含量变化，旨在为豆渣发酵利用寻找更佳途径。1 材料与方法 1.1材料与仪器1.1.1菌种杏鲍菇(Pleurotus eryngii)、平菇(Pleurotus ostreatus)、香菇(Lentinus edodes)、珍珠菇(Flammulina velutiper)、秀珍菇(Pleurotus geesteranus)均购自江苏省高淳区农林局食用菌研究所。1.1.2原料豆渣由江苏省苏州市金记食品有限公司提供。鲜豆渣于50°C烘干后打粉：水分含量7.17%，粗蛋白含量17.28%，粗脂肪含量6.72%，淀粉含量2.63%，不溶性膳食纤维(IDF)含量45.50%，可溶性膳食纤维(SDF)含量4.67%。1.1.3培养基斜面及平板培养基：采用PDA培养基（马铃薯20%，葡萄糖2%，琼脂1.5%，自然pH）；种子培养基：采用PD液体培养液(马铃薯20%，葡萄糖2%，自然pH)；豆渣培养基（发酵培养基）：豆渣处理液，自然pH。豆渣处理液制备工艺：新鲜豆渣挤去大部分水后于50 °C烘干打粉。加水配置30g/L的料液，料液经胶体磨匀浆处理5 min即为豆渣处理液。菌株生长速度比较培养基：PDA平板固体培养基；菌株发酵豆渣培养基添加1.5%琼脂，灌注于平皿。采用湿热灭菌法，置于121°C灭菌20 min。1.2 实验方法1.2.1生长速度游标卡尺测定。1.2.2 发酵种子液的制备将菌种接种至装有PDA培养基平板中央，于25°C培养12 d；用直径8 mm打孔器取4片菌丝体接种于装有50 mL PD培养基的250 mL三角瓶中，于25°C，摇床转速120 r/min条件下培养8 d，培养液在无菌条件下匀浆处理即得发酵种子液。1.2.3液态发酵将发酵种子液以10%(v/v)的接种量接种至装有50 mL豆渣培养基的250 mL三角瓶中，于25°C，摇床转速80 r/min条件下发酵8 d，各菌种均设3个重复。1.2.4酶活性测定粗酶液制备：发酵液于冷冻离心机中，在0~4°C、10 000 rpm离心15 min，上清液即为粗酶液。淀粉酶活性：在Kunamneni等[8]的方法上加以调整。取1 mL粗酶液添加至1mL 1%(w/v)的可溶性淀粉（由0.1 M pH 6.0醋酸钠缓冲溶液溶解）中，于50°C保温1 h，反应结束后，采用加热法终止酶反应(100°C，10 min)。用DNS法测定反应液中还原糖含量，以灭活粗酶液添加1 mL 1%可溶性淀粉为对照；淀粉酶活定义：1 mL粗酶液单位时间(1 min)在50°C水解可溶性淀粉产生1μmol葡萄糖定义为1个酶活单位(U/mL)。蛋白酶活性：在Wang等[9]的方法上加以调整。取0.5 mL粗酶液添加至0.5 mL的酪蛋白溶液中（酪蛋白用0.1 M的氢氧化钠溶液溶解，0.2 M pH为7的磷酸缓冲液定容），于37°C保持1 h，反应结束后，采用加热法终止酶反应(100°C，10 min)；用茚三酮比色法测定水解液中氨基态氮的含量，以灭活粗酶液添加1 mL 1.5%的酪蛋白溶液为对照；酶活定义：1 mL的粗酶液单位时间(1 min)在37°C水解酪蛋白产生1 μmol氨基态氮定义为1个酶活单位(U/mL)。纤维素C1酶活性：在Martins等[10] 的方法上加以调整。取50 mg干燥脱脂棉，剪碎后加入2.0 mL pH 5.0的0.1 M的柠檬酸缓冲液，加热至50°C；添加0.5 mL粗酶液于混合物中，于50°C水浴保持2 h，采用加热法终止酶反应(100°C，10 min)，冷却后用DNS比色法测定酶解液中还原糖增加量，以灭活粗酶液为对照；酶活定义：1 mL粗酶液单位时间(1 min)内50°C水解滤纸产生1μmol葡萄糖定义为1个酶活单位(U/mL)。纤维素C?酶活性：取酶液0.5 mL 加入2 mL质量分数为0.5%的羧甲基纤维素钠溶液（pH 5.0的0.1 M的柠檬酸缓冲液溶解）于65°C酶解30 min，后续步骤同C1酶活性测定，酶活力单位同C1酶的酶活力单位。纤维素βG酶活测定：取酶液0.5 mL 加入2 mL质量分数为0.5%的水杨素溶液(pH 5.0的0.1 M的柠檬酸缓冲液溶解)于65°C 酶解30 min，后续步骤同C1酶活性测定，酶活力单位同C1酶的酶活力单位。1.2.5膳食纤维豆渣原料直接取样，发酵样品于10 000 rpm离心后获得发酵上清液和发酵残渣，其中可溶性膳食纤维(SDF)由上清液中SDF和发酵残渣SDF中组成。固体样品及液体样品中可溶性膳食纤维(SDF)：参照谢碧霞等[11]方法；不溶性膳食纤维(IDF)：参照谢碧霞等[11]方法；以上均以干基计。总膳食纤维(TDF)=IDF+SDF。1.2.6其他指标测定水分含量：采用恒重法测定；淀粉含量：采用碘淀粉比色法测定；还原糖含量：采用3,5-二硝基水杨酸法测定；粗蛋白含量：采用微量凯氏定氮法测定；粗脂肪含量：采用索氏抽提法测定；灰分：采用GB 5009.4-2003总灰分测定方法；pH值：采用pH测试仪测定。1.3数据统计与分析实验设3次重复，采用SAS 9.2及SPSS 12.5统计软件进行分析。结果数据用均数±标准差(x±s)表示，不同组之间差异性采用one-way ANOVA方法进行比较，P<0.05表示差异显著具有统计学意义。2结果与分析2.1豆渣中主要成分如表2-1所示，豆渣中含量最高的是IDF，其次是蛋白质和脂肪，矿物元素（灰分含量3.25%）含量同样较丰富。研究表明豆渣中营养成分均衡，其碳源、氮源和矿质元素适宜微生物生长[12]。表2-1 豆渣主要化学成分含量（g/100g DW）成分水分淀粉粗蛋白质粗脂肪灰分IDFSDF含量7.17±0.092.63±0.1217.28±0.176.72±0.113.25±0.1345.50±0.504.67±0.132.2菌体生长速度表2-2 菌株在不同培养基中的生长速度菌种生长速度(mm·d-1)PDA培养基豆渣培养基杏鲍菇3.77±0.29d6.07±0.79b平菇9.48±0.59a9.41±0.02a香菇2.77±0.52c3.51±0.53d珍珠菇2.94±0.23c4.69±0.21c秀珍菇8.41±0.18b6.52±0.28b由表2-2可知，杏鲍菇、平菇、香菇、珍珠菇和秀珍菇在豆渣培养基中生长良好。其中，杏鲍菇、香菇和珍珠菇在豆渣培养基中的生长速度大于PDA培养基中；平菇在豆渣培养基中生长速度与PDA培养基中十分接近；而秀珍菇在豆渣培养基中生长速度小于PDA培养基中。由此可见，豆渣适合于大多数食用菌的生长，原因是豆渣中含有丰富的微生物生长所必需的碳源、氮源、微量元素和生长因子等。2.3发酵过程中酶活性变化2.3.1淀粉酶活性表2-3 发酵过程中食用菌淀粉酶活性菌种淀粉酶活性(mU·mL-1)2 d4 d6 d8 d杏鲍菇109.30±10.36a24.47±3.45d39.26±2.12d22.00±1.89e平菇60.97±4.44d62.45±4.93b141.37±5.42a84.81±3.15c香菇38.28±4.15c44.69±4.94c59.49±3.01c140.00±0.49a珍珠菇29.89±1.48c91.55±5.16a56.53±2.95c126.00±3.38b秀珍菇63.02±1.95b57.65±3.94b100.64±0.49b74.75±5.86d由表2-3所知，菌体在利用豆渣培养基发酵过程中体现出不同的淀粉酶活性特征。其中杏鲍菇和秀珍菇发酵生成淀粉酶活性最低，其最高点分别出现在发酵前期和发酵后期；平菇、香菇和珍珠菇在发酵过程中淀粉酶活性较高，又以平菇和香菇最高，分别于第6 d和8 d时达到141.37 mU/mL和140.00 mU/mL，两菌生产淀粉酶活性随发酵时间的延长而升高，其酶活最高点皆出现在发酵中后期。淀粉被水解生成单糖、二糖、三糖和短链糊精等被菌体利用。本研究旨在利用菌体发酵中产生的酶水解DF以外物质，以提高DF的产量和品质，因此，平菇、香菇和珍珠菇较适宜水解并利用豆渣中的淀粉。2.3.2蛋白酶活性表2-4 发酵过程中食用菌蛋白酶活性菌种蛋白酶活性(mU·mL-1)2 d4 d6 d8d杏鲍菇0.74±0.05d1.50±0.09c1.45±0.09b2.29±0.24a平菇1.85±0.11b1.84±0.13b1.15±0.08b1.38±0.12c香菇1.61±0.08c2.98±0.13a2.13±0.35a1.30±0.14c珍珠菇2.18±0.21a1.35±0.09c1.89±0.12a1.90±0.17b秀珍菇0.00±0.00e1.95±0.11b1.87±0.13a1.87±0.05b如表2-4所示，五种食用菌菌丝体在以豆渣为培养基生长时，生成的蛋白酶活性显著不同。其中以香菇生产蛋白酶能力为最强，第4 d达到最大值2.98 mU/mL；其次为杏鲍菇和珍珠菇，分别于第8 d和第2 d达到2.29和2.18 mU；平菇和秀珍菇蛋白酶活性相对较低，其中平菇在发酵前期蛋白酶活性较高，而秀珍菇在发酵中后期蛋白酶活性较高，并保持相对稳定的状态。五种食用菌都具有分解豆渣中蛋白质并将其归为己用的能力。2.3.3纤维素C1酶活性表2-5 发酵过程中食用菌纤维素C1酶活性菌种纤维素C1酶活性(mU·mL-1)2 d4 d6 d8d杏鲍菇19.46±0.48c23.90±1.18c31.67±2.58b13.54±1.55b平菇23.16±0.74b31.54±1.58a37.71±3.05a5.77±1.11c香菇20.69±0.81c26.86±1.24b10.58±0.85e3.42±0.34c珍珠菇27.10±2.12a13.54±0.87e14.77±1.01d5.37±1.24c秀珍菇10.26±0.31d20.35±0.30d23.29±2.28c18.40±1.57a由表2-5可知，五种食用真菌生成纤维素C1酶的情况显著不同，并且C1酶活性峰值出现时间也大不相同。珍珠菇生成C1酶活性最大值出现在第2 d，随后逐渐下降；香菇生成C1酶在发酵第4 d出现最大值，随后逐渐下降；杏鲍菇、平菇及秀珍菇生成C1酶活性随发酵时间逐渐升高，在第6 d达到最大，随后呈下降趋势；其中，平菇在第2、4、6 d的C1酶活性均高于其他四种食用真菌（发酵第2 d的珍珠菇除外），第6 d达到最大值37.71 mU/mL；杏鲍菇生成C1酶活性次之；以秀珍菇生成C1酶活性为最弱。纤维素C1酶又被称为外切葡聚糖酶，可将不溶性膳食纤维水解成为可溶的纤维糊精及纤维二糖，而后可溶性纤维糊精由C?酶进一步成为纤维二糖，所以较高的C1酶活性有助于膳食纤维的改性。2.3.4纤维素C?酶活性表2-6 发酵过程中食用菌纤维素C?酶活性菌种纤维素C?酶活性(mU·mL-1)2 d4 d6 d8 d杏鲍菇117.79±6.12a144.42±4.74a216.93±5.64a154.78±5.16a平菇98.55±1.24b122.23±3.55b160.70±9.45b142.78±3.15a香菇91.65±3.04c117.29±3.14b79.31±2.54c91.85±4.67b珍珠菇101.51±2.97b110.39±2.41c39.36±3.59d41.04±3.78d秀珍菇11.07±1.02d81.43±3.39d82.73±4.05c76.26±15.63c纤维素C?酶也被成为内切葡聚糖酶，主要作用于纤维素的末端，随机水解纤维素生成纤维二糖。五种食用真菌生成纤维素C?酶的情况显著不同，如表2-6。香菇、珍珠菇和秀珍菇生成纤维素C?酶活性较低，其中秀珍菇最低，始终低于82.73 mU/mL；杏鲍菇和平菇生成纤维素C?酶活性较高，又以杏鲍菇最好，其酶活最高可达216.93 mU/mL，其次是平菇，最高值为160.70 mU/mL，两种菌的纤维素C?酶均随发酵时间的延长而升高，发酵后期逐渐下降。纤维素C?酶的水解产物纤维素会使纤维素产量下降，因此较低的纤维素C?酶活性有助于提高纤维素的产量。2.3.5纤维素βG酶活性表2-7 发酵过程中食用菌纤维素βG酶活性菌种纤维素βG酶活性(mU·mL-1)2 d4 d6 d8d杏鲍菇94.11±3.55b95.59±9.84c139.98±9.47c98.55±4.66a平菇100.52±1.58b110.39±4.47b120.75±1.48c64.52±6.87c香菇74.88±3.98c100.03±3.25bc211.01±10.51b84.03±3.14b珍珠菇113.35±5.42a212.49±6.67a245.05±16.28a70.35±8.23c秀珍菇51.46±12.02d82.73±5.21d97.06±13.03d84.03±7.82b纤维素βG酶又被称为β-葡萄糖苷酶，其主要作用是将纤维二糖水解成为葡萄糖。五种食用真菌生成纤维素βG酶的活性具有显著差别，但各食用真菌的纤维素βG酶随发酵时间延长的变化趋势极其相似，见表2-7。香菇和珍珠菇的纤维素βG酶较高，又以珍珠菇最高，其酶活性最高达245.05 mU/mL，其次为香菇，为211.01 mU/mL；杏鲍菇、平菇和秀珍菇纤维素βG酶活性较低，其中以秀珍菇为最低，发酵期间始终低于100 mU/mL。纤维素βG酶能够消耗纤维素C?酶水解纤维素生成的纤维二糖，对纤维素C?酶的水解反作用具有促进作用，因此，较低的纤维素βG酶活性有利于提高纤维素的产量。2.4发酵过程中主要成分变化2.4.1可溶性蛋白含量变化图2-1 发酵过程中可溶性蛋白含量变化大豆中蛋白质含量高达35%，加工后的豆渣中蛋白质含量仍高达17.28%（表2-1），其中部分为可溶性蛋白。在食用真菌生成的蛋白酶作用下，蛋白质被水解为多肽、氨基酸等供菌体生长利用。五种食用真菌在发酵过程中培养基中可溶性蛋白质含量变化存在显著差异。香菇及珍珠菇对可溶性蛋白质利用能力最强，经发酵后培养基中可溶性蛋白含量最低；杏鲍菇和平菇次之；秀珍菇最弱。蛋白质作为主要氮源被真菌利用有利于菌丝体生长，并且较大程度水解蛋白质有利于提高膳食纤维品质。2.4.2游离氨基酸含量变化图2-2 发酵过程中游离氨基酸含量变化培养基中的游离氨基酸来源于豆渣及食用真菌水解产物，处于水解生成和被微生物利用的动态变化见图2-2。发酵初期，在菌体蛋白酶作用下氨基酸开始生成，含量增加；随着菌体快速生长，利用掉大部分所生产的氨基酸，氨基酸含量趋于平缓；其中，以第4 d平菇游离氨基酸含量最高，香菇最低；发酵结束后，游离氨基酸含量由高至低依次为：平菇、秀珍菇和珍珠菇、香菇及杏鲍菇。2.4.3还原糖含量变化图2-3 发酵过程中还原糖含量变化培养基中的还原糖大部分来源于豆渣中纤维素水解产生，与游离氨基酸一样处于水解生成和被微生物利用的动态变化，见图2-3。随着菌丝体的生长还原糖开始生成，其中，珍珠菇在发酵第2-6 d水解生成大量还原糖，第6 d达到最大值；香菇、平菇和杏鲍菇发酵全程呈现缓慢增加趋势；秀珍菇在发酵初期还原糖增加，第2 d后开始下降并趋于平缓；发酵结束后，还原糖含量由高至低依次为：珍珠菇、香菇、平菇、杏鲍菇和秀珍菇。2.5发酵后膳食纤维含量表2-3 发酵后膳食纤维含量菌种膳食纤维含量(%)IDFSDF杏鲍菇35.56±0.77a9.62±0.51d平菇33.24±2.51a20.49±0.38a香菇14.42±3.11c13.56±1.05b珍珠菇26.31±1.42b11.8±0.51c秀珍菇37.56±2.22a12.96±0.75bc如表2-3所示，经食用菌发酵后的豆渣培养基中膳食纤维含量发生显著变化。其中IDF含量经发酵后都显著低于未发酵样品（IDF含量为45.50%，见表2-1），SDF含量都显著高于未发酵样品（SDF含量为4.67%，见表2-1），其中，以平菇发酵后培养基中SDF含量为最高，为原料中的4.39倍。原因是在食用菌生长过程中会生成复杂的纤维素酶系（纤维素C1酶、Cx酶、βG酶等），在以上酶的作用下，IDF被分解利用，生成单糖、寡糖等小分子糖类供菌体生长所需，在该过程中SDF含量有所增加；并且单糖等小分子糖类被微生物利用后同样会生产菌丝体内的多糖，进一步提高了SDF含量。2.6相关性分析表2-9 膳食纤维与纤维素C1酶、C?酶及βG酶的相关性分析C1酶C?酶βG酶TDF0.220-0.143-0.268IDF-0.480-0.116-0.239SDF0.663-0.097-0.129如表2-9所示，膳食纤维与各食用真菌生成的纤维素C1酶、C?酶及βG酶具有一定的相关性。其中，豆渣经食用真菌发酵后的IDF含量与各菌生成纤维素C1酶呈负相关，相关系数为-0.480；SDF含量与纤维素C1酶呈正相关，相关系数为0.663；另外，IDF、SDF及TDF含量与纤维素C?酶、βG酶活性皆呈现负相关。3结论试验中所采用的五种食用真菌对IDF都具有一定的水解改性能力，在经过发酵后，SDF含量均得到提高。其中，以平菇发酵后SDF产量为最高，达到20.49%，提高了4.39倍，这与发酵过程中较高的C1酶活性和较低的C?酶及βG酶活性具有密切关系，这一结果表明平菇相比其他四种食用真菌具有更好的IDF改性效果；其次为香菇及秀珍菇，SDF分别提高2.90倍和2.78倍。4 致谢感谢顾振新教授，在本论文完成的后期给予了大量有力的指导，使其更加充实详尽。 这里我也要特别感谢师兄赵哲，在毕业实验期间他倾尽所学知识帮助我,指点我，从最基本的实验操作方法到后期数据处理,从论文的写作方法到排版技巧,无一不是在赵哲学长指点下完成的，从中我学到了许多非常实用的知识，真心感谢赵哲学长！参考文献[1] 吴占威, 胡志和. 大豆豆渣的生理功能及其在食品中的应用 [J]. 食品科学, 2012, 33 (19): 358-362.[2] 张振山, 叶素萍, 李泉, 等. 豆渣的处理与加工利用 [J]. 食品科学, 2004, 25 (10): 400-406.[3] 肖少香. 豆渣产品研发综述 [J]. 粮食科技与经济, 2006, (06): 45-48.[4] Riaz, M. 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目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1.1材料与仪器 2
1.1.1菌种 2
1.1.2原料 2
1.1.3培养基 2
1.2 实验方法 2
1.2.1生长速度 2
1.2.2 发酵种子液的制备 2
1.2.3液态发酵 2
1.2.4酶活性测定 2
1.2.5膳食纤维 3
1.2.6其他指标测定 3
1.3数据统计与分析 3
2结果与分析 3
2.1豆渣中主要成分 3
2.2菌体生长速度 4
2.3发酵过程中酶活性变化 4
2.3.1淀粉酶活性 4
2.3.2蛋白酶活性 4
2.3.3纤维素C1酶活性 5
2.3.4纤维素C?酶活性 5
2.4发酵过程中主要成分变化 6
2.4.1可溶性蛋白含量变化 6
2.4.2游离氨基酸含量变化 6
2.4.3还原糖含量变化 7
2.5发酵后膳食纤维含量 7
2.6相关性分析 7
3结论 8
4 致谢 8
参考文献 8
大豆膳食纤维改性技术研究
食品科学与工程 杨孟伽
引言
引言
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