生物发酵法生产无硝捆蹄甜菜来源
目 录
1 引言 1
1.1 亚硝酸盐的作用 1
1.2 亚硝酸盐的危害 1
1.3 替代亚硝酸盐发色作用的物质研究 2
1.4 能替代亚硝酸盐抑菌作用的物质研究 2
1.5 能够替代亚硝酸盐抗氧化作用的物质 2
1.6 选择甜菜生物发酵替代亚硝酸盐的原因 2
1.7 甜菜中硝酸盐转化条件的优化 3
1.8 腌制条件下甜菜硝酸盐转化条件的优化 3
1.9 研究目的与意义 3
1.10 研究内容 4
2 材料与方法 4
2.1 材料 4
2.2 试剂的使用 4
2.3 仪器与设备 5
2.4 实验方法 5
3 结果与讨论 8
3.3 耐硝酸盐性 9
3.4 温度对硝酸盐还原酶的影响 10
3.5 pH值对硝酸盐还原酶的影响 11
3.6 盐含量对硝酸盐还原酶的影响 11
3.7 菌液添加量对亚硝酸盐生成的影响 12
3.8 甜菜本身亚硝酸盐含量 12
3.9 甜菜本身硝酸盐含量 13
3.10 发酵甜菜汁亚硝酸盐含量 13
3.11 制成捆蹄各项检测数据计算分析 13
结 论 17
致 谢 18
参 考 文 献 19
1 引言
捆蹄是江苏淮安的一道名菜，距今已有百余年历史，该产品具有营养丰富，色泽酱红，鲜味浓郁，咸甜适中，荤而不腻，嚼后生津等特点，主要原料为猪前夹心肉[1]，是备受人们喜爱 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
的产品。但是传统腌肉制品加工中，添加到肉制品中的亚硝酸盐因具有形成特征光泽并且它还能够抑制肉毒梭状芽胞杆菌的生长[2]、抗氧化[3]、增强风味[4]等这些使它成为不可完全替代的多功能食品添加剂，可相应的也给消费者带来了危害。寻求能够替代亚硝酸盐的物质已经成为热门课题。据相关资料显示亚硝酸钠的国家标准最大使用量为150mg/kg，最大残留量为肉类罐头不得超过50mg/kg，肉制品不得超过30mg/kg[5]。
本课题研究的主要目的是利用微生物发酵甜菜使其产生亚硝酸盐用于制作捆蹄，从而从根本上解决捆蹄中合成亚硝酸盐带来的食品危害。
1.1 亚硝酸盐的作用
肉制品加工过程中，新鲜的肉中含有能够使肉类呈现出暗红色的还原型的肌红蛋白，但它是极其不稳定，容易被氧气氧化，使肉制品呈现出难看的黄色或绿色，影响产品的外在美观形象和销售率[6]。因此，在肉制品加工过程中经常会通过加入亚硝酸盐或硝酸盐，利用它们的发色作用来使肉制品保持其其特有的鲜红色，硝酸盐是可以在一定的生存环境条件作用下，被还原成亚硝酸盐，亚硝酸盐是一种能与肌红蛋白或血红蛋白在酸性条件下迅速反应的物质，造成的结果是产生美丽的鲜红色，这是由于这一过程中生成了亚硝基肌红蛋白或亚硝基血红蛋白。亚硝酸盐还能抑制微生物的生长繁殖，能够作为防腐保鲜剂使用，它对肉毒梭状芽抱杆菌具有最特殊且有效的抑制作用，降低了由于肉毒梭状芽抱杆菌带来的食品中毒。
1.2 亚硝酸盐的危害
亚硝酸盐能将血液中二价铁离子转化为三价铁离子，使血液中你正常血红蛋白变为高铁血红蛋白，失去携带氧气的能力，致使人体出现头晕、呕吐、恶心、皮肤发紫、全身无力的现象，严重者会因呼吸衰竭而致死等亚硝酸盐中毒症状[7]。此外，亚硝酸盐还有致使血管扩张、松驰平滑肌作用、血压下降；还可干扰碘的代谢功能，造成甲状腺肿大；亚硝酸盐还是强致癌物N-亚硝基化合物[8]的前体物，人体和食物中的亚硝酸盐与胺类或酰胺类同时存在，就有极大可能形成强致癌性的亚硝基化合物。
1.3 替代亚硝酸盐发色作用的物质研究
近年来很多专家致力于寻找替代亚硝酸盐发色作用的物质，朱英莲[9]将戊糖乳杆菌作为发色剂，通过调节与戊糖乳杆菌相关的5个因素：发酵时间、发酵温度、氯化钠浓度和乳酸菌接种量，来进行实验科学研究。她以发酵肉制品的红度值作为指标，通过一系列实验分析了解到戊糖乳杆菌能促进肉品发色，提高亮度、红度值，而且它还能够促进肉制品的安全性。王柏琴[10]用红曲色素代替亚硝酸盐的发色性来进行科学研究，他将不同浓度的红曲色素添加到发酵香肠中，同时以150mg/kg NaNO2作为对照，实验结果表明：将1600 mg/kg的红曲色素作为着色剂来制作的发酵香肠其颜色接近以150mg/kg NaNO2为发色剂制作的发酵香肠，且在4 ℃条件下还能够贮藏一个月，颜色始终保持稳定。檀胜江[11]利用碳氧血红蛋白来替代亚硝酸钠用于猪肉肠的制作，通过对其pH、色泽、挥发性盐基氮、脂肪氧化值及菌落总数的测定实验发现在一定条件下可以提高肉制品的各项感官和理化性能，他还用一系列毒性试验、喂养试验来进一步测定这类替代物的安全性能。
1.4 能替代亚硝酸盐抑菌作用的物质研究
亚硝酸盐能够抑制有害微生物的作用。经过这么多年的科学研究已经得知的抑菌替代物有乳酸菌发酵、山梨酸钾、乳酸 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
盐、抗氧化剂、辐射杀菌等。可以通过将其中某一替代物添加到肉罐头制品中，观察其在贮藏过程中的胀罐情况，获知结果同时通过对照了解添加多少替代物相当于添加了多少量的亚硝酸钠才有的效果，而将次磷酸钠代替亚硝酸盐添加到肉制品中，对肉毒梭状芽孢杆菌的抑制作用更好[12]，并且次磷酸钠还是相当安全的物质，适合作为肉制品的添加剂。
1.5 能够替代亚硝酸盐抗氧化作用的物质
经过这么多年的科学研究已经得知的抗氧化剂有抗坏血酸钠、茶多酚、肌肽等。张梦寒分别在猪肉、鸡肉中发现肌肽，这是一类能够抑制脂类物质的氧化并且防止肉的亮红颜色减褪的物质[13]，因此，肌肽可以用作天然抗氧化剂，并具将会有广阔的前景。茶多酚还可以抑制酯类化合物的氧化降低脂肪物质的氧化进程延长肉制品保质期。
1.6 选择甜菜生物发酵替代亚硝酸盐的原因
根据查阅文献，本课题拟利用蔬菜本身的硝酸盐配以微生物菌群可以产生亚硝酸盐作为亚硝酸盐的替代物。
蔬菜是一种天然的富含硝酸盐的物质[14]，可以将其选作为硝酸盐来源，将其广泛应用于天然有机腌肉制品中。利用具有硝酸盐还原性的微生物菌种，如木糖葡萄球菌、肉葡萄球菌等它们产生的硝酸还原酶可以在氧气浓度很低或者厌氧的条件下用于使硝酸离子还原成亚硝酸盐离子[15,16]。王永霞和于长青分别利用肉葡萄球菌和木糖葡萄球菌的硝酸还原性，对传统发酵肉中的优良发酵菌进行了分离和筛选[17,18]。利用甜菜自身所含的硝酸盐含量在1200 mg/kg左右，可以用于研究[19]，再加入肉葡萄球菌与木糖葡萄球菌将硝酸盐可控地转化为亚硝酸盐，再应用于捆蹄的腌制，由于是非直接添加亚硝酸盐，确保了亚硝酸盐的可控添加，保证了食品安全。同时在制作无硝捆蹄过程中，减少过量添加亚硝酸盐所造成的危害，获得与直接添加亚硝酸盐所腌制捆蹄产品相同色香味和组织形态的捆蹄产品。
1.7 甜菜中硝酸盐转化条件的优化
一般条件下甜菜中的硝酸盐转化成亚硝酸盐可以通过加盐直接腌制的方法，但这种方法耗时较长且其不均匀。炒熟的蔬菜久存之后，会有亚硝酸盐含量增加的问题，这是由于微生物的活动导致的。很多细菌都有硝酸还原酶，能够把硝酸盐还原成亚硝酸盐，使其含量上升。在特定的条件下，如酸性环境、适当的温度下，添加肉葡萄球菌与木糖葡萄球菌微生物菌群可以产生较多亚硝酸盐，从而提升甜菜的硝酸盐转化效率。
1 引言 1
1.1 亚硝酸盐的作用 1
1.2 亚硝酸盐的危害 1
1.3 替代亚硝酸盐发色作用的物质研究 2
1.4 能替代亚硝酸盐抑菌作用的物质研究 2
1.5 能够替代亚硝酸盐抗氧化作用的物质 2
1.6 选择甜菜生物发酵替代亚硝酸盐的原因 2
1.7 甜菜中硝酸盐转化条件的优化 3
1.8 腌制条件下甜菜硝酸盐转化条件的优化 3
1.9 研究目的与意义 3
1.10 研究内容 4
2 材料与方法 4
2.1 材料 4
2.2 试剂的使用 4
2.3 仪器与设备 5
2.4 实验方法 5
3 结果与讨论 8
3.3 耐硝酸盐性 9
3.4 温度对硝酸盐还原酶的影响 10
3.5 pH值对硝酸盐还原酶的影响 11
3.6 盐含量对硝酸盐还原酶的影响 11
3.7 菌液添加量对亚硝酸盐生成的影响 12
3.8 甜菜本身亚硝酸盐含量 12
3.9 甜菜本身硝酸盐含量 13
3.10 发酵甜菜汁亚硝酸盐含量 13
3.11 制成捆蹄各项检测数据计算分析 13
结 论 17
致 谢 18
参 考 文 献 19
1 引言
捆蹄是江苏淮安的一道名菜，距今已有百余年历史，该产品具有营养丰富，色泽酱红，鲜味浓郁，咸甜适中，荤而不腻，嚼后生津等特点，主要原料为猪前夹心肉[1]，是备受人们喜爱 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
的产品。但是传统腌肉制品加工中，添加到肉制品中的亚硝酸盐因具有形成特征光泽并且它还能够抑制肉毒梭状芽胞杆菌的生长[2]、抗氧化[3]、增强风味[4]等这些使它成为不可完全替代的多功能食品添加剂，可相应的也给消费者带来了危害。寻求能够替代亚硝酸盐的物质已经成为热门课题。据相关资料显示亚硝酸钠的国家标准最大使用量为150mg/kg，最大残留量为肉类罐头不得超过50mg/kg，肉制品不得超过30mg/kg[5]。
本课题研究的主要目的是利用微生物发酵甜菜使其产生亚硝酸盐用于制作捆蹄，从而从根本上解决捆蹄中合成亚硝酸盐带来的食品危害。
1.1 亚硝酸盐的作用
肉制品加工过程中，新鲜的肉中含有能够使肉类呈现出暗红色的还原型的肌红蛋白，但它是极其不稳定，容易被氧气氧化，使肉制品呈现出难看的黄色或绿色，影响产品的外在美观形象和销售率[6]。因此，在肉制品加工过程中经常会通过加入亚硝酸盐或硝酸盐，利用它们的发色作用来使肉制品保持其其特有的鲜红色，硝酸盐是可以在一定的生存环境条件作用下，被还原成亚硝酸盐，亚硝酸盐是一种能与肌红蛋白或血红蛋白在酸性条件下迅速反应的物质，造成的结果是产生美丽的鲜红色，这是由于这一过程中生成了亚硝基肌红蛋白或亚硝基血红蛋白。亚硝酸盐还能抑制微生物的生长繁殖，能够作为防腐保鲜剂使用，它对肉毒梭状芽抱杆菌具有最特殊且有效的抑制作用，降低了由于肉毒梭状芽抱杆菌带来的食品中毒。
1.2 亚硝酸盐的危害
亚硝酸盐能将血液中二价铁离子转化为三价铁离子，使血液中你正常血红蛋白变为高铁血红蛋白，失去携带氧气的能力，致使人体出现头晕、呕吐、恶心、皮肤发紫、全身无力的现象，严重者会因呼吸衰竭而致死等亚硝酸盐中毒症状[7]。此外，亚硝酸盐还有致使血管扩张、松驰平滑肌作用、血压下降；还可干扰碘的代谢功能，造成甲状腺肿大；亚硝酸盐还是强致癌物N-亚硝基化合物[8]的前体物，人体和食物中的亚硝酸盐与胺类或酰胺类同时存在，就有极大可能形成强致癌性的亚硝基化合物。
1.3 替代亚硝酸盐发色作用的物质研究
近年来很多专家致力于寻找替代亚硝酸盐发色作用的物质，朱英莲[9]将戊糖乳杆菌作为发色剂，通过调节与戊糖乳杆菌相关的5个因素：发酵时间、发酵温度、氯化钠浓度和乳酸菌接种量，来进行实验科学研究。她以发酵肉制品的红度值作为指标，通过一系列实验分析了解到戊糖乳杆菌能促进肉品发色，提高亮度、红度值，而且它还能够促进肉制品的安全性。王柏琴[10]用红曲色素代替亚硝酸盐的发色性来进行科学研究，他将不同浓度的红曲色素添加到发酵香肠中，同时以150mg/kg NaNO2作为对照，实验结果表明：将1600 mg/kg的红曲色素作为着色剂来制作的发酵香肠其颜色接近以150mg/kg NaNO2为发色剂制作的发酵香肠，且在4 ℃条件下还能够贮藏一个月，颜色始终保持稳定。檀胜江[11]利用碳氧血红蛋白来替代亚硝酸钠用于猪肉肠的制作，通过对其pH、色泽、挥发性盐基氮、脂肪氧化值及菌落总数的测定实验发现在一定条件下可以提高肉制品的各项感官和理化性能，他还用一系列毒性试验、喂养试验来进一步测定这类替代物的安全性能。
1.4 能替代亚硝酸盐抑菌作用的物质研究
亚硝酸盐能够抑制有害微生物的作用。经过这么多年的科学研究已经得知的抑菌替代物有乳酸菌发酵、山梨酸钾、乳酸 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
盐、抗氧化剂、辐射杀菌等。可以通过将其中某一替代物添加到肉罐头制品中，观察其在贮藏过程中的胀罐情况，获知结果同时通过对照了解添加多少替代物相当于添加了多少量的亚硝酸钠才有的效果，而将次磷酸钠代替亚硝酸盐添加到肉制品中，对肉毒梭状芽孢杆菌的抑制作用更好[12]，并且次磷酸钠还是相当安全的物质，适合作为肉制品的添加剂。
1.5 能够替代亚硝酸盐抗氧化作用的物质
经过这么多年的科学研究已经得知的抗氧化剂有抗坏血酸钠、茶多酚、肌肽等。张梦寒分别在猪肉、鸡肉中发现肌肽，这是一类能够抑制脂类物质的氧化并且防止肉的亮红颜色减褪的物质[13]，因此，肌肽可以用作天然抗氧化剂，并具将会有广阔的前景。茶多酚还可以抑制酯类化合物的氧化降低脂肪物质的氧化进程延长肉制品保质期。
1.6 选择甜菜生物发酵替代亚硝酸盐的原因
根据查阅文献，本课题拟利用蔬菜本身的硝酸盐配以微生物菌群可以产生亚硝酸盐作为亚硝酸盐的替代物。
蔬菜是一种天然的富含硝酸盐的物质[14]，可以将其选作为硝酸盐来源，将其广泛应用于天然有机腌肉制品中。利用具有硝酸盐还原性的微生物菌种，如木糖葡萄球菌、肉葡萄球菌等它们产生的硝酸还原酶可以在氧气浓度很低或者厌氧的条件下用于使硝酸离子还原成亚硝酸盐离子[15,16]。王永霞和于长青分别利用肉葡萄球菌和木糖葡萄球菌的硝酸还原性，对传统发酵肉中的优良发酵菌进行了分离和筛选[17,18]。利用甜菜自身所含的硝酸盐含量在1200 mg/kg左右，可以用于研究[19]，再加入肉葡萄球菌与木糖葡萄球菌将硝酸盐可控地转化为亚硝酸盐，再应用于捆蹄的腌制，由于是非直接添加亚硝酸盐，确保了亚硝酸盐的可控添加，保证了食品安全。同时在制作无硝捆蹄过程中，减少过量添加亚硝酸盐所造成的危害，获得与直接添加亚硝酸盐所腌制捆蹄产品相同色香味和组织形态的捆蹄产品。
1.7 甜菜中硝酸盐转化条件的优化
一般条件下甜菜中的硝酸盐转化成亚硝酸盐可以通过加盐直接腌制的方法，但这种方法耗时较长且其不均匀。炒熟的蔬菜久存之后，会有亚硝酸盐含量增加的问题，这是由于微生物的活动导致的。很多细菌都有硝酸还原酶，能够把硝酸盐还原成亚硝酸盐，使其含量上升。在特定的条件下，如酸性环境、适当的温度下，添加肉葡萄球菌与木糖葡萄球菌微生物菌群可以产生较多亚硝酸盐，从而提升甜菜的硝酸盐转化效率。
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