海蚬多糖乙酰化条件研究
目 录
1 引言1
1.1 海蚬的特性1
1.2 海蚬的成分1
1.3 海蚬多糖的具体作用1
1.4 本文研究的主要内容及目的意义2
2 实验材料和方法 3
2.1 实验材料3
2.2 研究方法3
3 结果与讨论6
3.1 多糖的提取6
3.2 单因素试验7
3.3 正交试验9
3.4 红外光谱分析9
3.5 样品抗氧化活性 10
4 实验过程讨论11
结论 13
致谢 14
参考文献 15
1 引言
1.1 海蚬的特性
海蚬又称青蛤，属软体动物门，双壳纲，青蛤属，为我国主要的水产贝类，在海洋水产业中具有重要地位。青蛤贝壳略呈圆形，长3 cm～5 cm，高3 cm～5 cm，厚约0.5 mm。壳外表黄白或青白色。壳顶歪向一方，并有以壳顶为中心的同心层纹，排列紧密，沿此纹或有数条灰蓝色轮纹，腹缘带细齿状，壳内面乳白色或青白色。光滑无纹。体轻，质坚硬略脆，断面 层纹不明显。气稍腥，味淡[1]。
1.2 海蚬的成分
海蚬肉质鲜美，营养丰富，富含蛋白质、氨基酸、脂类、糖类、矿物质元素。李晓英等[2]对海州湾冬季养殖的成体海蚬营养成分进行测定后发现海蚬肉中水分含量为77.23%，总糖含量为4.45%，粗蛋白含量为15.54%，灰分为4.91%、粗脂肪含量为1.86% *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
。而舒留泉等[3]以连云港沿海地区产的海蚬为材料，对其软体组织的营养成分进行研究却发现，海蚬肉的蛋白质含量（以干基计）为44.06%，脂肪含量（以干基计）为11.31%。表明不同地区产的海蚬在营养特性方面存在一定差异。另外，海蚬肉中不饱和脂肪酸的量占到脂肪总量的67.7%，其中单烯酸、多烯酸含量分别为24.9%、42.8%，DHA、EPA含量分别为11.3%、18.4%[4]。
海蚬富含氨基酸。海蚬肉含有18种编码氨基酸，其中人体必需氨基酸有10种。第一限制氨基酸为缬氨酸，氨基酸评分为50.8[5]。第二限制氨基酸为苯丙氨酸、酪氨酸，氨基酸评分为55.0；在所有检测到的氨基酸中谷氨酸含量最高，为116.5 mg/g。另外，海蚬的呈味氨基酸在总氨基酸中的比例在42%以上。必需氨基酸占总氨酸的比例约为45%，远高于WHO/FAO的推荐值（35.38%）[6]。表明海蚬是比较理想的蛋白资源。
1.3 海蚬多糖的具体作用
传统医学证实，海蚬软体组织水浸提物对发炎、哮喘、口腔溃疡等病症疗效较佳。海蚬水提物的生理活性可能与其富含多糖类物质有关[7]。研究表明，一些源于海洋贝类诸如文蛤、菲律宾蛤仔、翡翠贻贝的多糖具有抗肿瘤、消炎、免疫调节等方面的生理活性[8]，并且关于贝类多糖分离纯化、理化性质、单糖组成、结构等方面研究均有报道，而海蚬多糖已被证实具有抗肿瘤、抗病毒、抗感染、抗氧化、增强免疫力等多种生物学功能[9]。
查阅关于海蚬多糖的研究，海蚬多糖属于动物性多糖，含有一定量的糖蛋白[10]，采用Sevage法只能除去游离蛋白质，因此海蚬粗多糖的蛋白质可能是结合的糖蛋白。海蚬粗多糖通过DEAE-纤维素与Sephdex G-100（葡聚糖凝胶）凝胶柱层析法，分离纯化所得到的各个组分总糖质量分数、纯度均大大提高，并且能够将含有结合蛋白的组分与其他多糖组分进行有效地分离[11]。分离纯化后的海蚬粗多糖高对金属离子的螯合能力较强而粗多糖的还原力均显著低于Vc，并且海蚬多糖具有中等强度的还原力和中等强度的脂质过氧化抑制活性[12]。
1.4 本文研究的主要内容及目的意义
1.4.1 主要内容
以海蚬为实验材料，先进行原料处理，然后采用传统的水提醇沉工艺、Sevage脱蛋白工艺提取分离海蚬粗多糖。采用离子交换层析（DEAE-纤维素为阴离子填料）对粗多糖进行分离纯化，得到初步纯化产品。以初步纯化产品为原料进行乙酰化分子修饰反应，并通过单因素试验、正交试验，得到不同条件的影响结果，最后得出最优乙酰化化条件。
1.4.2 目的及意义
多糖的分子修饰和结构改造对于提高多糖的生物活性具有重要意义。多糖分子修饰的方法有很多，最常用的方法主要有硫酸化、磷酸化、乙酰化、羧甲基化等[13]。多糖乙酰化是指采用乙酰化反应在多糖支链上引入乙酰基。多糖乙酰化试剂主要有乙酸或乙酸酐，首先将多糖分散于溶剂中，随后加入乙酰化试剂来完成酰化反应。乙酰化部位一般发生在羟基氧或氨基氮上，乙酰化通过在多糖支链上引入乙酰基，使多糖空间构型发生变化，多糖羟基暴露而水溶性得到提高。一般来说，随着乙酰化程度提高，多糖溶解度增大，其生理活性也得到改善[14]。实验表明，褐藻糖胶、海藻糖胶经乙酰化后，与未乙酰化相比，对超氧自由基、DPPH自由基、羟自由基的清除能力明显提高，表现出较 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
强的体外抗氧化能力。红外光谱是研究分子修饰后多糖结构的重要手段，红外光谱常常通过检测多糖分子及不同原子间的极性共价键的振动来获取多糖结构信息。这些结构信息包括多糖的糖苷键构型（α型和β型）、糖环的形式（吡喃环和呋喃环）、有无取代基及种类[15]。
在国内，对于海蚬多糖性质及其抗氧化活性、抗癌活性已有一定程度的研究，对于各种乙酰化多糖也有很多研究。但是海蚬多糖的乙酰化研究还没有深入涉及到，所以我的毕业设计实验将对不同条件下乙酰化海蚬多糖的乙酰基含量进行测定，为寻找较好的抗氧化剂提供依据。
2 实验材料和方法
2.1 实验材料
2.1.1 实验原料
新鲜青蛤，购于连云港海鲜市场。
2.1.2 实验试剂
乙醇、氯仿、正丁醇、DEAE-纤维素、氢氧化钠、甲酰胺、乙酸酐、NBS、NBT、NADH、PMS、硫酸亚铁、水杨酸、H2O2等：均为分析纯试剂。
2.1.3 实验仪器与设备
表1 实验仪器与设备
实验仪器 型号 出产厂家
可见分光光度计 721 上海菁华科技仪器有限公司
DEAE-纤维素层析柱 2.6 cm × 30 cm 上海亚荣生化仪器有限公司
电脑全自动部份收集器 DBS-100A 上海沪西分析仪器厂
旋转蒸发器 Laborota-400 Heidolph公司
组织匀浆机 TYL-350 山东九阳小家电有限公司
数显恒温水浴锅 HH-4 常州国华电器有限公司
电脑数显恒流泵 DHL-ZB 上海沪西分析仪器厂
超低温冷冻冰箱 EDW-40-108LA 日本松下电器有限公司
傅里叶变换分光光度计 Nicolet5700 美国Varian公司
2.2 研究方法
2.1.1 工艺流程
6 2 1 2 13.56
7 3 3 2 11.45
1 引言1
1.1 海蚬的特性1
1.2 海蚬的成分1
1.3 海蚬多糖的具体作用1
1.4 本文研究的主要内容及目的意义2
2 实验材料和方法 3
2.1 实验材料3
2.2 研究方法3
3 结果与讨论6
3.1 多糖的提取6
3.2 单因素试验7
3.3 正交试验9
3.4 红外光谱分析9
3.5 样品抗氧化活性 10
4 实验过程讨论11
结论 13
致谢 14
参考文献 15
1 引言
1.1 海蚬的特性
海蚬又称青蛤，属软体动物门，双壳纲，青蛤属，为我国主要的水产贝类，在海洋水产业中具有重要地位。青蛤
1.2 海蚬的成分
海蚬肉质鲜美，营养丰富，富含蛋白质、氨基酸、脂类、糖类、矿物质元素。李晓英等[2]对海州湾冬季养殖的成体海蚬营养成分进行测定后发现海蚬肉中水分含量为77.23%，总糖含量为4.45%，粗蛋白含量为15.54%，灰分为4.91%、粗脂肪含量为1.86% *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
。而舒留泉等[3]以连云港沿海地区产的海蚬为材料，对其软体组织的营养成分进行研究却发现，海蚬肉的蛋白质含量（以干基计）为44.06%，脂肪含量（以干基计）为11.31%。表明不同地区产的海蚬在营养特性方面存在一定差异。另外，海蚬肉中不饱和脂肪酸的量占到脂肪总量的67.7%，其中单烯酸、多烯酸含量分别为24.9%、42.8%，DHA、EPA含量分别为11.3%、18.4%[4]。
海蚬富含氨基酸。海蚬肉含有18种编码氨基酸，其中人体必需氨基酸有10种。第一限制氨基酸为缬氨酸，氨基酸评分为50.8[5]。第二限制氨基酸为苯丙氨酸、酪氨酸，氨基酸评分为55.0；在所有检测到的氨基酸中谷氨酸含量最高，为116.5 mg/g。另外，海蚬的呈味氨基酸在总氨基酸中的比例在42%以上。必需氨基酸占总氨酸的比例约为45%，远高于WHO/FAO的推荐值（35.38%）[6]。表明海蚬是比较理想的蛋白资源。
1.3 海蚬多糖的具体作用
传统医学证实，海蚬软体组织水浸提物对发炎、哮喘、口腔溃疡等病症疗效较佳。海蚬水提物的生理活性可能与其富含多糖类物质有关[7]。研究表明，一些源于海洋贝类诸如文蛤、菲律宾蛤仔、翡翠贻贝的多糖具有抗肿瘤、消炎、免疫调节等方面的生理活性[8]，并且关于贝类多糖分离纯化、理化性质、单糖组成、结构等方面研究均有报道，而海蚬多糖已被证实具有抗肿瘤、抗病毒、抗感染、抗氧化、增强免疫力等多种生物学功能[9]。
查阅关于海蚬多糖的研究，海蚬多糖属于动物性多糖，含有一定量的糖蛋白[10]，采用Sevage法只能除去游离蛋白质，因此海蚬粗多糖的蛋白质可能是结合的糖蛋白。海蚬粗多糖通过DEAE-纤维素与Sephdex G-100（葡聚糖凝胶）凝胶柱层析法，分离纯化所得到的各个组分总糖质量分数、纯度均大大提高，并且能够将含有结合蛋白的组分与其他多糖组分进行有效地分离[11]。分离纯化后的海蚬粗多糖高对金属离子的螯合能力较强而粗多糖的还原力均显著低于Vc，并且海蚬多糖具有中等强度的还原力和中等强度的脂质过氧化抑制活性[12]。
1.4 本文研究的主要内容及目的意义
1.4.1 主要内容
以海蚬为实验材料，先进行原料处理，然后采用传统的水提醇沉工艺、Sevage脱蛋白工艺提取分离海蚬粗多糖。采用离子交换层析（DEAE-纤维素为阴离子填料）对粗多糖进行分离纯化，得到初步纯化产品。以初步纯化产品为原料进行乙酰化分子修饰反应，并通过单因素试验、正交试验，得到不同条件的影响结果，最后得出最优乙酰化化条件。
1.4.2 目的及意义
多糖的分子修饰和结构改造对于提高多糖的生物活性具有重要意义。多糖分子修饰的方法有很多，最常用的方法主要有硫酸化、磷酸化、乙酰化、羧甲基化等[13]。多糖乙酰化是指采用乙酰化反应在多糖支链上引入乙酰基。多糖乙酰化试剂主要有乙酸或乙酸酐，首先将多糖分散于溶剂中，随后加入乙酰化试剂来完成酰化反应。乙酰化部位一般发生在羟基氧或氨基氮上，乙酰化通过在多糖支链上引入乙酰基，使多糖空间构型发生变化，多糖羟基暴露而水溶性得到提高。一般来说，随着乙酰化程度提高，多糖溶解度增大，其生理活性也得到改善[14]。实验表明，褐藻糖胶、海藻糖胶经乙酰化后，与未乙酰化相比，对超氧自由基、DPPH自由基、羟自由基的清除能力明显提高，表现出较 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
强的体外抗氧化能力。红外光谱是研究分子修饰后多糖结构的重要手段，红外光谱常常通过检测多糖分子及不同原子间的极性共价键的振动来获取多糖结构信息。这些结构信息包括多糖的糖苷键构型（α型和β型）、糖环的形式（吡喃环和呋喃环）、有无取代基及种类[15]。
在国内，对于海蚬多糖性质及其抗氧化活性、抗癌活性已有一定程度的研究，对于各种乙酰化多糖也有很多研究。但是海蚬多糖的乙酰化研究还没有深入涉及到，所以我的毕业设计实验将对不同条件下乙酰化海蚬多糖的乙酰基含量进行测定，为寻找较好的抗氧化剂提供依据。
2 实验材料和方法
2.1 实验材料
2.1.1 实验原料
新鲜青蛤，购于连云港海鲜市场。
2.1.2 实验试剂
乙醇、氯仿、正丁醇、DEAE-纤维素、氢氧化钠、甲酰胺、乙酸酐、NBS、NBT、NADH、PMS、硫酸亚铁、水杨酸、H2O2等：均为分析纯试剂。
2.1.3 实验仪器与设备
表1 实验仪器与设备
实验仪器 型号 出产厂家
可见分光光度计 721 上海菁华科技仪器有限公司
DEAE-纤维素层析柱 2.6 cm × 30 cm 上海亚荣生化仪器有限公司
电脑全自动部份收集器 DBS-100A 上海沪西分析仪器厂
旋转蒸发器 Laborota-400 Heidolph公司
组织匀浆机 TYL-350 山东九阳小家电有限公司
数显恒温水浴锅 HH-4 常州国华电器有限公司
电脑数显恒流泵 DHL-ZB 上海沪西分析仪器厂
超低温冷冻冰箱 EDW-40-108LA 日本松下电器有限公司
傅里叶变换分光光度计 Nicolet5700 美国Varian公司
2.2 研究方法
2.1.1 工艺流程
6 2 1 2 13.56
7 3 3 2 11.45
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