真空包装熟制禽肉中腐败菌的潜能分析
本次试验以真空包装的熟制禽肉为研究对象，首先采用平板划线分离的方法分离出真空包装熟制禽肉中的腐败菌群，再根据菌落特征的观察、16S rDNA测序法对样品中主要腐败菌进行鉴定，最后构建系统发育树来表示各菌株之间的同源可信度。试验研究结果表明引起真空包装熟制禽肉腐败变质的主要菌群有葡萄球菌属(Staphylococcus sp.)、拉恩氏菌属(Rahnella sp.)、环丝菌属(Brochothrix sp.)、弧菌属(Vibrio sp.)、乳酸菌属（Lactobacillus sp.）、串珠菌属（?Leuconostoc sp.）、哈夫尼菌属（Hafnia sp.）、沙雷氏菌属（Serratia sp.）、肉杆菌属（Carnobacterium sp.）、变形杆菌属（Proteus sp.）等。?
目录
摘要? 4
关键词 4
Abstract. 4
Keywords 4
引言 4
1 材料与方法 5
1．1 实验材料 5
1．2 试剂与仪器 5
1．3 方法 5
1. 3. 1 样品前处理及取样 5
1．3．2 细菌分离 5
1．3．3 菌落形态观察 6
1．3．4 煮沸法[5]提取细菌基因组DNA 6
1． 3． 5 16S rDNA法[7]鉴定腐败菌 6
2 结果分析与讨论 6
2．1 细菌菌落特征 6
2．2 16S rDNA鉴定结果 14
2．3 系统发育分析 18
致谢 18
参考文献 18
真空包装熟制禽肉中腐败菌的潜能分析
引言
造成食品质量损失的一大重要因素是微生物的污染，微生物污染可以破坏细胞的结构，使得细胞内营养物质流失，从而影响了食品的质地、口味、气味[1]。近年来我国的肉制品产业不断的发展起来，但在肉制品产量和消费量增长的同时，微生物导致肉制品的腐败问题也成为了肉制品产业发展中的一大瓶颈。熟制禽肉制品的贮藏时间除了与禽肉制品的加工方法以及禽肉制品中的水分含量有关外,还与杀 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
菌后的操作处理以及包装技术有关[2]。现在比较常用的熟制禽肉制品的包装技术主要有气调包装技术、真空包装技术、罐头包装技术等[3]。
真空包装技术能够延长肉制品的货架期，是熟制禽肉制品的一大重要保藏方式。肉制品的真空包装的可以防止肉制品的二次污染，阻止肉制品中好氧性微生物的生长，同时延缓肉制品的氧化变质；但肉制品的真空包装不能无限制的延长肉制品的货架期，即使真空包装技术在很大程度上抑制了需氧性微生物的生长，但厌氧性微生物仍然能够大量的繁殖[4]。本文主要通过传统的平板划线分离菌株的方法对熟制禽肉制品中的腐败菌群进行分离纯化，再采用菌落特征观察、16S rDNA测序法对样品中的主要腐败菌进行分离鉴定。旨在能够为熟制禽肉制品的保存提供科学合理的手段，从而延长熟制禽肉制品的货架期。
1 材料与方法
1．1 实验材料
零售熟制禽肉样品44份，购于南京的各大超市、农贸市场、卤菜店共计11个采样地点（图1）。其中熟制鸡爪5份，熟制鸭爪1份，熟制鸭翅9份，熟制翅根2份，熟制鸡腿1份，熟制鸭腿1份，熟制翅尖2份，盐水鸭8份，酱鸭5份，牦牛肉2份，盐水肫2份，白斩鸡1份，烧鸡2份，盐鸡3份。
/
图1 采样点分布
1．2 试剂与仪器
胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)、胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)、细菌琼脂粉 青岛高科园海波生物技术有限公司。
氯化钠、磷酸二氢钠、十二水合磷酸氢二钠 南京化学试剂股份有限公司。
磷酸盐缓冲液（pH 7.2，0.1M）：0.2M磷酸二氢钠水溶液28.0mL中加入0.2M磷酸氢二钠水溶液72.0mL，加水定容至200mL。
用于PCR 扩增的全套试剂和扩增引物，上海生工生物工程技术服务有限公司。
真空充气包装机（浙江葆春包装机械总公司）；生物安全柜，The Baker Company；均质拍打机，法国Interscience公司；TGL16B离心机，上海安亭科学仪器厂；HPP 260培养箱，德国Memmert公司；梯度PCR仪，美国Applied Biosystems公司；Mixing Block MB102恒温振荡金属浴，杭州博日科技有限公司；HWE50高压蒸汽灭菌锅，日本Hirayama公司。
1．3 方法
1. 3. 1 样品前处理及取样 将市场购买来的样品进行真空包装后，放置于12℃条件下放置，待有明显腐败现象（出汁、涨袋、变色、发粘等）时取出。在无菌条件下每份样品中取出25g（挑去骨头），同时加入125ml无菌生理盐水，置于均质袋中均质，洗脱菌体。
1．3．2 细菌分离 接种环蘸取菌液接种于TSA平板上，分区划线。每份样品取三块TSA平板于28℃需氧条件下培养24~48h，另取三块TSA平板于28℃厌氧条件下培养24~48h。于不同培养条件下的每份样品中各挑取3株长势良好、典型生长的菌落，在TSA平板上分区划线，对样品的菌株进行分离纯化直至得到最终的单菌落。
1．3．3 菌落形态的观察 观察并记录已经分离纯化的单菌落的形态，其中包括菌落的颜色、大小、形状、光泽、边缘、透明度、隆起度、质地、表面状态等。
1．3．4 煮沸法[5]提取细菌基因组DNA 取TSB菌液1ml，12000 r /min离心5min富集菌体，弃去上清液，加入100μL的无菌水，涡旋混匀，100℃金属浴8min后立即冰浴8~10min，8000r /min?离心4min，以上清液为模板，－20℃保存备用。
1． 3． 5 16S rDNA法[7]鉴定腐败菌 以27F(5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’)和1492R(5’GGTTACCTTGTTACGACTT3’) 为引物，聚合酶链式反应(PCR)扩增菌株的16S rDNA基因。反应体系为25μL：GoTaq Green Master Mix (2×)12.5μL；上下游引物各1 μL，模板DNA4μL，加无菌去离子水补至25μL。PCR反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸90s，30个循环；72℃延伸10 min；结束后4℃保温。将扩增成功的样品送至生物公司进行测序处理，测序引物与扩增引物相同，测序长度为1500 bp左右。将所得序列置于NCBI网站进行BLAST比对，获得相似性98%以上的菌株，使用MEGA5.10和Clustalx软件构建系统发育树。
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摘要? 4
关键词 4
Abstract. 4
Keywords 4
引言 4
1 材料与方法 5
1．1 实验材料 5
1．2 试剂与仪器 5
1．3 方法 5
1. 3. 1 样品前处理及取样 5
1．3．2 细菌分离 5
1．3．3 菌落形态观察 6
1．3．4 煮沸法[5]提取细菌基因组DNA 6
1． 3． 5 16S rDNA法[7]鉴定腐败菌 6
2 结果分析与讨论 6
2．1 细菌菌落特征 6
2．2 16S rDNA鉴定结果 14
2．3 系统发育分析 18
致谢 18
参考文献 18
真空包装熟制禽肉中腐败菌的潜能分析
引言
造成食品质量损失的一大重要因素是微生物的污染，微生物污染可以破坏细胞的结构，使得细胞内营养物质流失，从而影响了食品的质地、口味、气味[1]。近年来我国的肉制品产业不断的发展起来，但在肉制品产量和消费量增长的同时，微生物导致肉制品的腐败问题也成为了肉制品产业发展中的一大瓶颈。熟制禽肉制品的贮藏时间除了与禽肉制品的加工方法以及禽肉制品中的水分含量有关外,还与杀 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
菌后的操作处理以及包装技术有关[2]。现在比较常用的熟制禽肉制品的包装技术主要有气调包装技术、真空包装技术、罐头包装技术等[3]。
真空包装技术能够延长肉制品的货架期，是熟制禽肉制品的一大重要保藏方式。肉制品的真空包装的可以防止肉制品的二次污染，阻止肉制品中好氧性微生物的生长，同时延缓肉制品的氧化变质；但肉制品的真空包装不能无限制的延长肉制品的货架期，即使真空包装技术在很大程度上抑制了需氧性微生物的生长，但厌氧性微生物仍然能够大量的繁殖[4]。本文主要通过传统的平板划线分离菌株的方法对熟制禽肉制品中的腐败菌群进行分离纯化，再采用菌落特征观察、16S rDNA测序法对样品中的主要腐败菌进行分离鉴定。旨在能够为熟制禽肉制品的保存提供科学合理的手段，从而延长熟制禽肉制品的货架期。
1 材料与方法
1．1 实验材料
零售熟制禽肉样品44份，购于南京的各大超市、农贸市场、卤菜店共计11个采样地点（图1）。其中熟制鸡爪5份，熟制鸭爪1份，熟制鸭翅9份，熟制翅根2份，熟制鸡腿1份，熟制鸭腿1份，熟制翅尖2份，盐水鸭8份，酱鸭5份，牦牛肉2份，盐水肫2份，白斩鸡1份，烧鸡2份，盐鸡3份。
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图1 采样点分布
1．2 试剂与仪器
胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)、胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)、细菌琼脂粉 青岛高科园海波生物技术有限公司。
氯化钠、磷酸二氢钠、十二水合磷酸氢二钠 南京化学试剂股份有限公司。
磷酸盐缓冲液（pH 7.2，0.1M）：0.2M磷酸二氢钠水溶液28.0mL中加入0.2M磷酸氢二钠水溶液72.0mL，加水定容至200mL。
用于PCR 扩增的全套试剂和扩增引物，上海生工生物工程技术服务有限公司。
真空充气包装机（浙江葆春包装机械总公司）；生物安全柜，The Baker Company；均质拍打机，法国Interscience公司；TGL16B离心机，上海安亭科学仪器厂；HPP 260培养箱，德国Memmert公司；梯度PCR仪，美国Applied Biosystems公司；Mixing Block MB102恒温振荡金属浴，杭州博日科技有限公司；HWE50高压蒸汽灭菌锅，日本Hirayama公司。
1．3 方法
1. 3. 1 样品前处理及取样 将市场购买来的样品进行真空包装后，放置于12℃条件下放置，待有明显腐败现象（出汁、涨袋、变色、发粘等）时取出。在无菌条件下每份样品中取出25g（挑去骨头），同时加入125ml无菌生理盐水，置于均质袋中均质，洗脱菌体。
1．3．2 细菌分离 接种环蘸取菌液接种于TSA平板上，分区划线。每份样品取三块TSA平板于28℃需氧条件下培养24~48h，另取三块TSA平板于28℃厌氧条件下培养24~48h。于不同培养条件下的每份样品中各挑取3株长势良好、典型生长的菌落，在TSA平板上分区划线，对样品的菌株进行分离纯化直至得到最终的单菌落。
1．3．3 菌落形态的观察 观察并记录已经分离纯化的单菌落的形态，其中包括菌落的颜色、大小、形状、光泽、边缘、透明度、隆起度、质地、表面状态等。
1．3．4 煮沸法[5]提取细菌基因组DNA 取TSB菌液1ml，12000 r /min离心5min富集菌体，弃去上清液，加入100μL的无菌水，涡旋混匀，100℃金属浴8min后立即冰浴8~10min，8000r /min?离心4min，以上清液为模板，－20℃保存备用。
1． 3． 5 16S rDNA法[7]鉴定腐败菌 以27F(5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’)和1492R(5’GGTTACCTTGTTACGACTT3’) 为引物，聚合酶链式反应(PCR)扩增菌株的16S rDNA基因。反应体系为25μL：GoTaq Green Master Mix (2×)12.5μL；上下游引物各1 μL，模板DNA4μL，加无菌去离子水补至25μL。PCR反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸90s，30个循环；72℃延伸10 min；结束后4℃保温。将扩增成功的样品送至生物公司进行测序处理，测序引物与扩增引物相同，测序长度为1500 bp左右。将所得序列置于NCBI网站进行BLAST比对，获得相似性98%以上的菌株，使用MEGA5.10和Clustalx软件构建系统发育树。
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