土壤微生物来源的聚酮化合物的分离与纯化
微生物是天然产物的重要来源，天然产物是开发临床药物的重要资源。通过建立土壤宏基因组文库，利用不依懒于微生物培养的宏基因组学方法发现环境微生物的天然产物。宏基因组学是研究特定环境下，生态群体中全部微生物的基因功能，以及微生物为了适应环境的生物进化、多样性以及功能活性、微生物之间的互相竞争、微生物与特殊环境之间相互作用产生特异代谢产物的新科学领域。本试验就是利用构建的珠穆朗玛峰宏基因组文库，筛选获得含有芳香聚酮基因的阳性克隆。并对其可能含有完整芳香聚酮合酶基因簇的阳性克隆转化子在蓝色链霉菌中异源表达的。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法3
1.1实验材料及设备3
1.1.1样品3
1.1.2培养基3
1.1.3菌体3
1.1.4载体3
1.1.5设计与酶3
1.1.6仪器设备3
1.2实验方法4
1.2.1研究方法4
1.2.2表达聚铜单克隆4
1.2.2.1单克隆质粒的电转4
1.2.2.2聚酮单克隆异源表达的方法4
1.2.2.3发酵5
1.2.2.4化合物提取5
1.2.2.5凝胶柱粗分离5
1.2.2.6高效液相色谱法纯化（HPLC纯化）5
2结果与分析6
2.1HPLC检测6
2.1.11336编号发酵粗提物HPLC检测6
2.1.2凝胶柱粗分离后HPLC检测6
2.1.3HPLC分离得到纯品后检测7
3讨论7
致谢8
参考文献8
土壤微生物来源的聚酮化合物的分离与纯化
引言
引言: 自1981年以来，约80%的抗癌药物和50%的美国食品药品管理局(FDA)批准的药物来自微生物的天然产物[1]。己知的抗菌、抗病毒、抗肿瘤活性的天然产物超过一半的数量也是微生物产生的[2]。1875年，John Tyndall发现了青霉菌真菌的抗菌性；1928年 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
，Fleeting发现了青霉素；后来，青霉素便作为抗感染药物挽救了众多的生命。1943年，Waksman等[3]从土壤中分离得一种放线菌——“灰色链霉素”，成为治疗肺结核的重要药物。环境中微生物资源的多样性，在某种程度上决定了其代谢产物生物活性的多样性。随着这种传统微生物培养方法的深入研究，发现并找到的化合物重复率越来越高，新结构化合物的获得也相应越来越少、越来越困难。研究表明，只有少于1%的微生物可以培养于现有的试验室条件下[4]。而且大多数的微生物为不可培养性的微生物。这极大地限制了用传统的微生物培养方法对微生物天然产物的发现[5]。所以微生物天然产物的发现迫切需要一种新的思路和方法来研究[6]。
微生物是天然产物的重要来源，天然产物是开发临床药物的重要资源。通过建立土壤宏基因组文库，利用不依懒于微生物培养的宏基因组学方法发现环境微生物的天然产物。环境埋藏物是很大的新抗生素的来源。土壤微生物环境蕴含着巨大的天然产物的资源宝库[7]。据研究证明，在1克土壤样品中，包括数千种独特的微生物[8,9]，但是大部分自然界发现的微生物并不能够直接在试验室培养，这极大的限制了微生物资源的开发与利用。Handelsman Jo， Jon Clardy及Robert M. Goodman等[10,11]在1998年提出宏基因组学的概念，在特定的微生物系统中收集所有的微生物基因组。
宏基因组学在土壤微生物研究中的应用主要是进行微生物生态学方面的研究，揭示土壤中微生物的多样性及其与环境之间的关系。土壤宏基因组学的基本策略包括：从环境样本中直接提取微生物总DNA，离心，电泳纯化去除繁殖酸化，透析，浓缩后获得高质量的DAN片段，将DAN片段克隆到适合的载体上，转化宿主菌，构建宏基因组织文库。然后对文库通过筛选，来发现特意的基因或具有生物活性的化合物。
1 聚酮化合物（Polyketides）
聚酮类化合物(Polyketide PK) 是由植物、细菌、真菌将低级梭酸进行连续缩合反应，得到的天然产物的化合物。由于生物合成过程中构型的改变及其组合方式的多种形式，使形成的化合物数量极其庞大。同时，结构的多样性造成了生物活性的多样性。数据显示，2005到2007两年间，聚酮类药物产值高达200亿美元[12]，这说明其具有重要的医用价值。而研究者用分子遗传学、生物化学和生物信息学等多种手段研究，也为聚酮类药物的研发开辟了新的道路。
目前，人们普遍认为PKS可以分为3类——I型、II型、III型。其中，I型也被称为模块类，它由多个催化结构域通过共价连接的方式组成模块，再由多个模块构成多功能酶复合体，进而合成大环内酯类抗生素，如西罗莫司、利福霉素、红霉素等。II型也被称为芳香类或叠代，其含有的各个催化结构域均为独立的蛋白，其主要合成芳香族的化合物，如四环化合物及蒽环类化合物。一般而言，I型和II型通常通过ACP活化酰基CoA底物，而III型则直接作用于酰基CoA活化的简单羧酸[13]。
1.1聚酮化合物的生物合成
人工合成聚酮化合物，主要包括合成起始单元、选择碳链的延伸、酮基还原、芳香化以及环化等步骤。目前所知，PKS的I型，可合成大环安莎类、多烯类、内酯类和聚醚类聚酮化合物；II型，主要合成具有芳香环结构的聚酮化合物；III型则属于查而酮合成酶类。
1.2 II型聚酮化合物
II型聚酮合酶(PKS II)也称为芳香族聚酮合酶[14]，于1984年首次发现[15,16]。II型多酮酶是一种具有多功能的酶复合物，它包含了一组可重用结构或，分别为ACP、连长决定因子（CLF，也称KS β）、KS/AT，每个结构域都能在重复的反应步骤中多次催化相同的反应。除此，II型聚酮化合物是微生物天然产物中的重要组成部分，且具有抗胆固醇、抗菌、抗病毒和抗癌特性（如抗生素四环素，具有抗菌素耐药性；多柔比星，具有抗癌作用）。因此，该类化合物在医药、畜牧上得到非常广泛的应用。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法3
1.1实验材料及设备3
1.1.1样品3
1.1.2培养基3
1.1.3菌体3
1.1.4载体3
1.1.5设计与酶3
1.1.6仪器设备3
1.2实验方法4
1.2.1研究方法4
1.2.2表达聚铜单克隆4
1.2.2.1单克隆质粒的电转4
1.2.2.2聚酮单克隆异源表达的方法4
1.2.2.3发酵5
1.2.2.4化合物提取5
1.2.2.5凝胶柱粗分离5
1.2.2.6高效液相色谱法纯化（HPLC纯化）5
2结果与分析6
2.1HPLC检测6
2.1.11336编号发酵粗提物HPLC检测6
2.1.2凝胶柱粗分离后HPLC检测6
2.1.3HPLC分离得到纯品后检测7
3讨论7
致谢8
参考文献8
土壤微生物来源的聚酮化合物的分离与纯化
引言
引言: 自1981年以来，约80%的抗癌药物和50%的美国食品药品管理局(FDA)批准的药物来自微生物的天然产物[1]。己知的抗菌、抗病毒、抗肿瘤活性的天然产物超过一半的数量也是微生物产生的[2]。1875年，John Tyndall发现了青霉菌真菌的抗菌性；1928年 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
，Fleeting发现了青霉素；后来，青霉素便作为抗感染药物挽救了众多的生命。1943年，Waksman等[3]从土壤中分离得一种放线菌——“灰色链霉素”，成为治疗肺结核的重要药物。环境中微生物资源的多样性，在某种程度上决定了其代谢产物生物活性的多样性。随着这种传统微生物培养方法的深入研究，发现并找到的化合物重复率越来越高，新结构化合物的获得也相应越来越少、越来越困难。研究表明，只有少于1%的微生物可以培养于现有的试验室条件下[4]。而且大多数的微生物为不可培养性的微生物。这极大地限制了用传统的微生物培养方法对微生物天然产物的发现[5]。所以微生物天然产物的发现迫切需要一种新的思路和方法来研究[6]。
微生物是天然产物的重要来源，天然产物是开发临床药物的重要资源。通过建立土壤宏基因组文库，利用不依懒于微生物培养的宏基因组学方法发现环境微生物的天然产物。环境埋藏物是很大的新抗生素的来源。土壤微生物环境蕴含着巨大的天然产物的资源宝库[7]。据研究证明，在1克土壤样品中，包括数千种独特的微生物[8,9]，但是大部分自然界发现的微生物并不能够直接在试验室培养，这极大的限制了微生物资源的开发与利用。Handelsman Jo， Jon Clardy及Robert M. Goodman等[10,11]在1998年提出宏基因组学的概念，在特定的微生物系统中收集所有的微生物基因组。
宏基因组学在土壤微生物研究中的应用主要是进行微生物生态学方面的研究，揭示土壤中微生物的多样性及其与环境之间的关系。土壤宏基因组学的基本策略包括：从环境样本中直接提取微生物总DNA，离心，电泳纯化去除繁殖酸化，透析，浓缩后获得高质量的DAN片段，将DAN片段克隆到适合的载体上，转化宿主菌，构建宏基因组织文库。然后对文库通过筛选，来发现特意的基因或具有生物活性的化合物。
1 聚酮化合物（Polyketides）
聚酮类化合物(Polyketide PK) 是由植物、细菌、真菌将低级梭酸进行连续缩合反应，得到的天然产物的化合物。由于生物合成过程中构型的改变及其组合方式的多种形式，使形成的化合物数量极其庞大。同时，结构的多样性造成了生物活性的多样性。数据显示，2005到2007两年间，聚酮类药物产值高达200亿美元[12]，这说明其具有重要的医用价值。而研究者用分子遗传学、生物化学和生物信息学等多种手段研究，也为聚酮类药物的研发开辟了新的道路。
目前，人们普遍认为PKS可以分为3类——I型、II型、III型。其中，I型也被称为模块类，它由多个催化结构域通过共价连接的方式组成模块，再由多个模块构成多功能酶复合体，进而合成大环内酯类抗生素，如西罗莫司、利福霉素、红霉素等。II型也被称为芳香类或叠代，其含有的各个催化结构域均为独立的蛋白，其主要合成芳香族的化合物，如四环化合物及蒽环类化合物。一般而言，I型和II型通常通过ACP活化酰基CoA底物，而III型则直接作用于酰基CoA活化的简单羧酸[13]。
1.1聚酮化合物的生物合成
人工合成聚酮化合物，主要包括合成起始单元、选择碳链的延伸、酮基还原、芳香化以及环化等步骤。目前所知，PKS的I型，可合成大环安莎类、多烯类、内酯类和聚醚类聚酮化合物；II型，主要合成具有芳香环结构的聚酮化合物；III型则属于查而酮合成酶类。
1.2 II型聚酮化合物
II型聚酮合酶(PKS II)也称为芳香族聚酮合酶[14]，于1984年首次发现[15,16]。II型多酮酶是一种具有多功能的酶复合物，它包含了一组可重用结构或，分别为ACP、连长决定因子（CLF，也称KS β）、KS/AT，每个结构域都能在重复的反应步骤中多次催化相同的反应。除此，II型聚酮化合物是微生物天然产物中的重要组成部分，且具有抗胆固醇、抗菌、抗病毒和抗癌特性（如抗生素四环素，具有抗菌素耐药性；多柔比星，具有抗癌作用）。因此，该类化合物在医药、畜牧上得到非常广泛的应用。
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