不同碳源对瑞士乳杆菌产多糖结构和生理功能的影响
不同碳源对瑞士乳杆菌产多糖结构和生理功能的影响[20200509182655]
摘要：本文主要研究不同碳源对瑞士乳杆菌MB2-1胞外多糖的结构和生理功能影响的研究，以HP培养基为基础，更换其中的碳源（葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、半乳糖），在接种发酵提取瑞士乳杆菌MB2-1胞外多糖后，分析产量和成分的差异，并进行结构分析，抗氧化、抗肿瘤特性研究。实验结果：胞外粗多糖产量，以半乳糖为碳源333.5mg/L，以果糖为碳源368.8mg/L，以葡萄糖为碳源363.0mg/L，以蔗糖为碳源354.4mg/L，以乳糖为碳源388.1mg/L；胞外多糖成分分析，蛋白质、糖醛酸、硫酸基含量表现出差异性；单糖组成分析显示出五种粗多糖主要由甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成，红外光谱分析结果为五种粗多糖为吡喃型聚糖；体外抗氧化结果表明五种粗多糖具有较强的DPPH自由基清除能力、羟基自由基清除能力和螯合金属离子能力；抗肿瘤的结果显示，五种胞外粗多糖对肝癌细胞HEPG-2有明显的抑制作用，且抑制活性随浓度的升高而增加，大小顺序为以乳糖为碳源的抑制率>葡萄糖>半乳糖>果糖>蔗糖。
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关键字:瑞士乳杆菌；胞外多糖；结构；抗氧化；抗肿瘤
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.2 方法 2
1.2.1 瑞士乳杆菌的发酵及胞外多糖提取2
1.2.2 瑞士乳杆菌胞外多糖含量分析2
1.2.3 瑞士乳杆菌胞外多糖结构分析3
1.2.4胞外多糖体外抗氧化活性4
1.2.5胞外多糖的体外抗肿瘤活性4
2 结果分析5
2.1 瑞士乳杆菌胞外多糖含量分析5
2.2 瑞士乳杆菌胞外多糖成分分析5
2.3胞外多糖结构分析6
2.4胞外多糖体外抗氧化活性分析11
2.5胞外多糖的体外抗肿瘤活性分析13
3 讨论14
致谢14
参考文献14
不同碳源对瑞士乳杆菌产多糖结构和生理功能的影响
引言
乳酸菌是一类能利用可发酵性糖类产生大量乳酸的细菌的通称。目前这类细菌在分类学上至少有23个属，而在食品、医药等领域应用较多的主要有7个属[1]。许多乳酸菌是人体肠道固有的有益菌，研究人员对其开发与应用做了大量的工作，也取得了一定成果[2]。
胞外多糖是乳酸菌在生长代谢过程中分泌到细胞壁外常渗于培养基的一类糖类化合物，有的依附于微生物细胞壁形成荚膜，称为荚膜多糖；有的进入培养基形成粘液，称为粘液多糖。乳酸菌胞外多糖是培养基中的荚膜多糖和粘液多糖的总和。它们都是微生物代谢次产物[3]。乳酸菌胞外多糖可赋予发酵乳制品特殊的质构和风味，起到安全的食品添加剂的作用，而广泛用于各种食品的增稠、稳定、乳化、胶凝及 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$
持水。乳酸菌胞外多糖对酸奶的品质的影响主要表现在增加酸奶的粘性，提高酸奶的持水性防止乳清析出，增强凝乳强度，增加酸奶的口感等。近年来，对乳酸菌胞外多糖的研究逐渐增多，首先是益生菌酸奶在国内外日渐红火，对益生菌酸奶功能的深入探讨是乳酸菌胞外多糖研究的必然。其次，多糖的保健功能也是有目共睹的，像抗肿瘤、抑菌、消炎、调节免疫等，乳酸菌胞外多糖作为多糖的一个重要来源也必然是研究的重要对象。对于不同碳源的培养基培养乳酸菌，其胞外多糖的结构和生理功能的研究目前还不多，本课题从碳源着手，确定五种碳源（葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、半乳糖），配置成HP培养基培养瑞士乳杆菌，对其五种胞外多糖结构和生理功能进行研究，旨在更好的发现探究胞外多糖的性质。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 菌种及肝癌细胞
高产黏瑞士乳杆菌MB2-1(Lactobacillus helveticusMB2-1)为大学食品科技学院微生物实验室从新疆拜城县传统赛里木酸奶分离和保存；人肝癌细胞HEPG-2。
1．1．2 试剂材料及仪器
1．1．2．1 试剂材料
葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、半乳糖，95％乙醇，浓硫酸，大豆蛋白胨，80％TCA，牛肉膏，母浸出粉，吐温-80；牛血清蛋白，考马斯亮蓝，苯酚，葡萄糖醛酸，硫化钡；DPPH，菲咯啉，菲咯嗪；三氟乙酸，吡啶，肌醇，盐酸羟胺，乙酸酐；MTT，DMEM，DMSO，胰蛋白酶，PBS缓冲液；甲醛，标准LB培养基等。
1．1．2．1 仪器
722可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司），LRH系列生化培养箱（上海一恒科技有限公司），Hei-VAP Advantage(HL)旋转蒸发仪（Heidolph，德国），Welch DRYFAST干式隔膜真空泵（Welch，美国），Heto PowerDry LL3000真空冷冻干燥器机（Thermo，美国），Nicolet IR200 红外光谱仪（Thermo，美国），Thermo Scientific Formo 311型CO2培养箱（Thermo，美国），BX-50型倒置显微镜（Olympus，日本），SW-CJ-IBU美国宝特-2酶标仪（BioTek公司，美国），Agilent 6890N型气相色谱仪。
1．2 试验方法
1．2．1 瑞士乳杆菌的发酵及胞外多糖的提取
1．2．1．1 培养基配置
改良HP培养基：碳源（葡萄、糖乳糖、半乳糖、蔗糖、果糖)20g，硫酸亚铁0.04g，吐温-80 1mL，大豆蛋白胨20g，无水硫酸镁0.2g，一水合硫酸锰0.06g，牛肉膏 10g，酵母浸出粉6g，柠檬酸铵5g，加入1L蒸馏水溶解过滤后121℃，20min灭菌备用。
1．2．1．2 瑞士乳杆菌发酵及胞外多糖提取
改良HP培养基→灭菌→甘油管接种活化→第二次活化→发酵→离心→加入TCA→离心取上清液→旋转蒸发→乙醇沉淀→离心取沉淀→热溶解→离心取上清液→透析→离心取上清液→旋转蒸发→冷冻干燥→密闭保存
1．2．2 瑞士乳杆菌胞外多糖含量分析
1．2．2．1 蛋白质含量的测定
以牛血清白蛋白为标准样品，采用考马斯亮蓝法，测定多糖样品中 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$
蛋白质的含量。
标准曲线的制作：分别取100μg/mL的牛血清白蛋白溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL置于六个同等规格的试管中，加水补齐至1.0mL。然后分别加入5.0mL的考马斯亮蓝染液，各管混匀，室温下放置5min，以空白牛血清白蛋白溶液管作为空白参比，测定595nm波长下的吸光度值。以蛋白质含量（μg）为横坐标，吸光度值作纵坐标绘制标准曲线，并得出回归方程。取0.5mL多糖溶液（浓度为1mg/mL）于试管中，平行三次，分别加蒸馏水补齐至1.0mL，测定各自的吸光度值，求三管A595的平均值。
1．2．2．2 糖醛酸含量的测定
以葡萄糖醛酸为标准样品，采用间羟基联苯比色法，测定多糖样品中的糖醛酸含量。
标准曲线的制作：精密量取葡萄糖醛酸溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL于具塞试管中，加水至1.0 mL，在冰浴中预冷后加入0.0125 mol/L四硼酸钠硫酸溶液6mL，摇匀，在沸水浴中煮沸12 min。取出以冰浴冷却至室温，分别加入0.15%间羟联苯溶液80μL，摇匀室温放置40min。以1.0mL蒸馏水同上操作制得空白对照，于525nm处测定吸光度，以葡萄糖醛酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标作标准曲线。取0.5mL多糖溶液（浓度为1mg/mL）于试管中，替代标准品溶液，后续操作一样，平行三次，测定各自的吸光度值，求三管A525的平均值。
1．2．2．3 硫酸基含量的测定
以硫酸钾为标准样品，采用氯化钡-明胶比色法，测定多糖样品中硫酸基的含量。
样品处理：称取多糖样品10mg置于5mL容量瓶中，加入1mol/LHCl溶液1mL于100℃水浴中，水解4h，冷却后，加盐酸溶液补至刻度线，用滤纸过滤，除去不溶物质（或8000r/min离心20min过滤），即得多糖粗样品(2mg/mL)，保存备用。
标准曲线的制作：精密称取105℃干燥至衡重的K2SO4 108.75mg，以1mol/L的HCl溶解，定容至100mL量瓶中，摇匀，即得硫酸基标准贮备液（0.6mg/mL）。准确吸取标准K2SO4溶液0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16、0.18，0.2mL，各以HCl溶液补至0.2mL，以0.2mL HCl溶液作为空白，加入三氯乙酸3.8mL及氯化钡溶液1.0mL，摇匀，室温静置15min，于360nm测吸收度A1；以1.0mL的明胶溶液代替氯化钡溶液依法操作，测吸收度A2，以硫酸基毫克数为横坐标，纵坐标为吸收度(A1-A2)值，得标准曲线，确定线性范围。其中每点做三个平行样品，取平均值。
摘要：本文主要研究不同碳源对瑞士乳杆菌MB2-1胞外多糖的结构和生理功能影响的研究，以HP培养基为基础，更换其中的碳源（葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、半乳糖），在接种发酵提取瑞士乳杆菌MB2-1胞外多糖后，分析产量和成分的差异，并进行结构分析，抗氧化、抗肿瘤特性研究。实验结果：胞外粗多糖产量，以半乳糖为碳源333.5mg/L，以果糖为碳源368.8mg/L，以葡萄糖为碳源363.0mg/L，以蔗糖为碳源354.4mg/L，以乳糖为碳源388.1mg/L；胞外多糖成分分析，蛋白质、糖醛酸、硫酸基含量表现出差异性；单糖组成分析显示出五种粗多糖主要由甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成，红外光谱分析结果为五种粗多糖为吡喃型聚糖；体外抗氧化结果表明五种粗多糖具有较强的DPPH自由基清除能力、羟基自由基清除能力和螯合金属离子能力；抗肿瘤的结果显示，五种胞外粗多糖对肝癌细胞HEPG-2有明显的抑制作用，且抑制活性随浓度的升高而增加，大小顺序为以乳糖为碳源的抑制率>葡萄糖>半乳糖>果糖>蔗糖。
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关键字:瑞士乳杆菌；胞外多糖；结构；抗氧化；抗肿瘤
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.2 方法 2
1.2.1 瑞士乳杆菌的发酵及胞外多糖提取2
1.2.2 瑞士乳杆菌胞外多糖含量分析2
1.2.3 瑞士乳杆菌胞外多糖结构分析3
1.2.4胞外多糖体外抗氧化活性4
1.2.5胞外多糖的体外抗肿瘤活性4
2 结果分析5
2.1 瑞士乳杆菌胞外多糖含量分析5
2.2 瑞士乳杆菌胞外多糖成分分析5
2.3胞外多糖结构分析6
2.4胞外多糖体外抗氧化活性分析11
2.5胞外多糖的体外抗肿瘤活性分析13
3 讨论14
致谢14
参考文献14
不同碳源对瑞士乳杆菌产多糖结构和生理功能的影响
引言
乳酸菌是一类能利用可发酵性糖类产生大量乳酸的细菌的通称。目前这类细菌在分类学上至少有23个属，而在食品、医药等领域应用较多的主要有7个属[1]。许多乳酸菌是人体肠道固有的有益菌，研究人员对其开发与应用做了大量的工作，也取得了一定成果[2]。
胞外多糖是乳酸菌在生长代谢过程中分泌到细胞壁外常渗于培养基的一类糖类化合物，有的依附于微生物细胞壁形成荚膜，称为荚膜多糖；有的进入培养基形成粘液，称为粘液多糖。乳酸菌胞外多糖是培养基中的荚膜多糖和粘液多糖的总和。它们都是微生物代谢次产物[3]。乳酸菌胞外多糖可赋予发酵乳制品特殊的质构和风味，起到安全的食品添加剂的作用，而广泛用于各种食品的增稠、稳定、乳化、胶凝及 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$
持水。乳酸菌胞外多糖对酸奶的品质的影响主要表现在增加酸奶的粘性，提高酸奶的持水性防止乳清析出，增强凝乳强度，增加酸奶的口感等。近年来，对乳酸菌胞外多糖的研究逐渐增多，首先是益生菌酸奶在国内外日渐红火，对益生菌酸奶功能的深入探讨是乳酸菌胞外多糖研究的必然。其次，多糖的保健功能也是有目共睹的，像抗肿瘤、抑菌、消炎、调节免疫等，乳酸菌胞外多糖作为多糖的一个重要来源也必然是研究的重要对象。对于不同碳源的培养基培养乳酸菌，其胞外多糖的结构和生理功能的研究目前还不多，本课题从碳源着手，确定五种碳源（葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、半乳糖），配置成HP培养基培养瑞士乳杆菌，对其五种胞外多糖结构和生理功能进行研究，旨在更好的发现探究胞外多糖的性质。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 菌种及肝癌细胞
高产黏瑞士乳杆菌MB2-1(Lactobacillus helveticusMB2-1)为大学食品科技学院微生物实验室从新疆拜城县传统赛里木酸奶分离和保存；人肝癌细胞HEPG-2。
1．1．2 试剂材料及仪器
1．1．2．1 试剂材料
葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、半乳糖，95％乙醇，浓硫酸，大豆蛋白胨，80％TCA，牛肉膏，母浸出粉，吐温-80；牛血清蛋白，考马斯亮蓝，苯酚，葡萄糖醛酸，硫化钡；DPPH，菲咯啉，菲咯嗪；三氟乙酸，吡啶，肌醇，盐酸羟胺，乙酸酐；MTT，DMEM，DMSO，胰蛋白酶，PBS缓冲液；甲醛，标准LB培养基等。
1．1．2．1 仪器
722可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司），LRH系列生化培养箱（上海一恒科技有限公司），Hei-VAP Advantage(HL)旋转蒸发仪（Heidolph，德国），Welch DRYFAST干式隔膜真空泵（Welch，美国），Heto PowerDry LL3000真空冷冻干燥器机（Thermo，美国），Nicolet IR200 红外光谱仪（Thermo，美国），Thermo Scientific Formo 311型CO2培养箱（Thermo，美国），BX-50型倒置显微镜（Olympus，日本），SW-CJ-IBU美国宝特-2酶标仪（BioTek公司，美国），Agilent 6890N型气相色谱仪。
1．2 试验方法
1．2．1 瑞士乳杆菌的发酵及胞外多糖的提取
1．2．1．1 培养基配置
改良HP培养基：碳源（葡萄、糖乳糖、半乳糖、蔗糖、果糖)20g，硫酸亚铁0.04g，吐温-80 1mL，大豆蛋白胨20g，无水硫酸镁0.2g，一水合硫酸锰0.06g，牛肉膏 10g，酵母浸出粉6g，柠檬酸铵5g，加入1L蒸馏水溶解过滤后121℃，20min灭菌备用。
1．2．1．2 瑞士乳杆菌发酵及胞外多糖提取
改良HP培养基→灭菌→甘油管接种活化→第二次活化→发酵→离心→加入TCA→离心取上清液→旋转蒸发→乙醇沉淀→离心取沉淀→热溶解→离心取上清液→透析→离心取上清液→旋转蒸发→冷冻干燥→密闭保存
1．2．2 瑞士乳杆菌胞外多糖含量分析
1．2．2．1 蛋白质含量的测定
以牛血清白蛋白为标准样品，采用考马斯亮蓝法，测定多糖样品中 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$
蛋白质的含量。
标准曲线的制作：分别取100μg/mL的牛血清白蛋白溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL置于六个同等规格的试管中，加水补齐至1.0mL。然后分别加入5.0mL的考马斯亮蓝染液，各管混匀，室温下放置5min，以空白牛血清白蛋白溶液管作为空白参比，测定595nm波长下的吸光度值。以蛋白质含量（μg）为横坐标，吸光度值作纵坐标绘制标准曲线，并得出回归方程。取0.5mL多糖溶液（浓度为1mg/mL）于试管中，平行三次，分别加蒸馏水补齐至1.0mL，测定各自的吸光度值，求三管A595的平均值。
1．2．2．2 糖醛酸含量的测定
以葡萄糖醛酸为标准样品，采用间羟基联苯比色法，测定多糖样品中的糖醛酸含量。
标准曲线的制作：精密量取葡萄糖醛酸溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL于具塞试管中，加水至1.0 mL，在冰浴中预冷后加入0.0125 mol/L四硼酸钠硫酸溶液6mL，摇匀，在沸水浴中煮沸12 min。取出以冰浴冷却至室温，分别加入0.15%间羟联苯溶液80μL，摇匀室温放置40min。以1.0mL蒸馏水同上操作制得空白对照，于525nm处测定吸光度，以葡萄糖醛酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标作标准曲线。取0.5mL多糖溶液（浓度为1mg/mL）于试管中，替代标准品溶液，后续操作一样，平行三次，测定各自的吸光度值，求三管A525的平均值。
1．2．2．3 硫酸基含量的测定
以硫酸钾为标准样品，采用氯化钡-明胶比色法，测定多糖样品中硫酸基的含量。
样品处理：称取多糖样品10mg置于5mL容量瓶中，加入1mol/LHCl溶液1mL于100℃水浴中，水解4h，冷却后，加盐酸溶液补至刻度线，用滤纸过滤，除去不溶物质（或8000r/min离心20min过滤），即得多糖粗样品(2mg/mL)，保存备用。
标准曲线的制作：精密称取105℃干燥至衡重的K2SO4 108.75mg，以1mol/L的HCl溶解，定容至100mL量瓶中，摇匀，即得硫酸基标准贮备液（0.6mg/mL）。准确吸取标准K2SO4溶液0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16、0.18，0.2mL，各以HCl溶液补至0.2mL，以0.2mL HCl溶液作为空白，加入三氯乙酸3.8mL及氯化钡溶液1.0mL，摇匀，室温静置15min，于360nm测吸收度A1；以1.0mL的明胶溶液代替氯化钡溶液依法操作，测吸收度A2，以硫酸基毫克数为横坐标，纵坐标为吸收度(A1-A2)值，得标准曲线，确定线性范围。其中每点做三个平行样品，取平均值。
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