枯草芽孢杆菌凝乳酶的分离纯化
枯草芽孢杆菌凝乳酶的分离纯化[20200509183609]
摘要：采用硫酸铵分级沉淀、Sephadex G-100分子筛和DEAE-纤维素离子交换柱层析等分离手段对枯草芽孢杆菌PNG27凝乳酶进行分离纯化，得到电泳纯的凝乳酶。结果表明，SDS-PAGE电泳分析凝乳酶分子质量约为32kDa，比活力由5.5U/mg提高为222.6U/mg，提高了近40倍，回收率为48.8%，酶的纯化倍数为6.8倍，为研究枯草芽孢杆菌凝乳酶的性质提供依据。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
关键字:枯草芽孢杆菌凝乳酶；分离；纯化
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1材料与方法1
1.1材料与试剂 1
1.1.1菌种2
1.1.2培养基2
1.1.3仪器与设备2
1.2方法 2
1.2.1培养方法2
1.2.2粗酶液制备2
1.2.3 Sephadex G-100分子筛层析2
1.2.4 DEAE-纤维素离子交换层析2
1.2.5 SDS-PAGE 电泳2
1.2.6 凝乳酶活力检测2
1.2.7蛋白含量测定3
2结果与分析3
2.1硫酸铵分级沉淀3
2.2 Sephadex G-100分子筛层析3
2.3 DEAE-纤维素离子交换层析4
2.4 SDS-PAGE 电泳分析4
2.5 凝乳酶纯化结果5
3讨论 5
致谢7
参考文献7
枯草芽孢杆菌凝乳酶的分离纯化
引言
传统生产所用的凝乳酶主要是从刚出生的小牛第四胃中提取的活性皱胃酶，随着世界奶酪产业的壮大，凝乳酶的需求量大增，单纯靠屠宰大量小牛来获取凝乳酶显然与现代工业的发展不相符[1]。目前，国际市场上的凝乳酶主要有动物源凝乳酶、植物源凝乳酶以及微生物源凝乳酶。虽然动物源凝乳酶的凝乳活力与蛋白水解能力的比值高，但是动物生长较慢且价格较高，不适应当今发展的需要；植物源凝乳酶蛋白水解能力强，其生产也受时间、地域等条件制约[2]；而微生物源凝乳酶凭借其凝乳活力高、产量大、成本低、制备简单等优 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
点成为当前的研究热点。
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是一种非常重要的产酶菌， 主要原因在于它能够产生和分泌大量的胞外酶。虽然目前枯草芽孢杆菌并不是主要的微生物来源凝乳酶产生菌，但因为其在焙烤食品中有较高凝乳活力，所以运用枯草芽孢杆菌生产凝乳酶的相关研究具有比较深远的意义[3]。丁明亮等对枯草芽孢杆菌产凝乳酶发酵条件通过单因素试验和响应面法进行了优化，得出最优发酵工艺：葡萄糖添加量16.2 g/L（质量浓度）、接种量0.130%（体积分数）、发酵时间120.34 h，所得酶活力(1129.05±74.55)SU/mL[4]。目前对枯草芽孢杆菌生产凝乳酶的研究主要为培养基的优化，而研究其分离纯化的较少。
本研究利用枯草芽孢杆菌PNG27发酵生产凝乳酶，通过硫酸铵分级沉淀，Sephadex G-100分子筛层析和DEAE-纤维素离子交换层析得到纯化的凝乳酶。为进一步研究其酶学性质奠定了基础。
1 材料与方法
1．1 材料与试剂
1．1．1 菌种
枯草芽孢杆菌PNG27，本实验室保存。
1．1．2 培养基
①NA培养基：牛肉浸膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，琼脂18.0 g，蒸馏水1 000 mL，pH=7.0；②BPY培养基：牛肉浸膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，酵母膏5.0 g，NaCl 5.0 g，葡萄糖10.0 g，蒸馏水1 000 mL，pH=7.0；③三角瓶发酵培养基:：脱脂奶粉10.0 g，小麦粉16.0 g，大豆蛋白胨8.0 g，NaCl 10.0 g，蒸馏水1 000 mL，pH=7.0。
1．1．3 仪器与设备
全温摇瓶柜；冷冻离心机；DF-1集热式磁力加热搅拌器：江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；HL-2恒流泵、DBS-100电脑全自动部分收集器：上海沪西分析仪器厂有限公司；UV-2450型紫外分光光度计；7200型分光光度计；数显恒温水浴锅：国华电器有限公司。
1．2 方法
1．2．1 培养方法
从保藏的枯草芽孢杆菌PNG27中挑取部分接到NA斜面，于37℃培养24 h，然后将BPY培养基作为种子培养基，从活化后的菌株斜面上转移菌株至BPY培养基中（接种量为两环），37℃，180 r/ min条件下培养11 h，按4%的接种量接入三角瓶发酵培养基中，装液量200 mL/ 1 000 mL摇瓶，33℃，180 r/ min条件下培养36 h。
1．2．2 粗酶液制备
1 000 ml枯草芽孢杆菌凝乳酶的发酵液经8 000 r/ min 离心10 min，离心温度4℃，收集上清液。将上清液置于磁力搅拌器中搅拌，冰浴条件下，缓慢加入研磨成粉末的硫酸铵，使其饱和度达到20%，4℃静置过夜。8 000 r/ min 离心10 min，离心温度4 ℃，收集上清液。冰浴条件下继续向上清液中缓慢加入研磨成粉末的硫酸铵，使其饱和度达到70%，4℃静置过夜。12 000 r/ min 离心15 min，离心温度4 ℃，弃上清液，沉淀溶于0.05 mol/ L的磷酸钠缓冲液中，4℃透析过夜，超滤浓缩后即得粗酶液。
1．2．3 S *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
ephadex G-100分子筛层析
Sephadex G-100装柱后先用0.05 mol/ L，pH值为6.8的磷酸钠缓冲液平衡，取2 ml粗酶液上柱，用0.05 mol/ L，pH值为6.8的磷酸钠缓冲液洗脱（0.5 ml/ min），检测波长280 nm，收集合并洗脱峰，超滤浓缩后测定酶活力。
1．2．4 DEAE-纤维素离子交换层析
取1 ml Sephadex G-100分离后得到的酶液，采用高盐离子浓度梯度分离纯化蛋白，DEAE-纤维素离子交换层析柱预先用0.05 mol/ L，pH值为6.6的磷酸钠缓冲液平衡，以含有不同NaCl浓度（0.1 mol/ L、0.2 mol/ L、0.3 mol/ L、0.5 mol/ L）的0.05 mol/ L，pH值为6.6的磷酸钠缓冲液进行梯度洗脱（0.5 ml/ min），收集合并吸收峰，超滤浓缩后测定酶活力。
1．2．5 SDS-PAGE 电泳
取40 μL样品与10 μL上样缓冲液混合，沸水浴5 min，5000 r/ min 离心5 min，取20 μL上清进行SDS-PAGE 电泳( 分离胶浓度12%，浓缩胶为3%) 。电泳结束后凝胶用考马斯亮蓝R-250 染色，脱色液脱色。
1．6．6 凝乳酶活力检测
[2] 姜峰, 张兰威. 我国凝乳酶特性及其替代品的研究现状[J]. 食品研究与开发, 2003. 12(6): 3-6.
[3] Shieha C J, Thib L A P, Shih I L. Milk-clotting Enzymes Produced by Culture of Bacillus subtilis natto[J]. Biochemical Engineering Journal, 2009, 43: 85-91.
摘要：采用硫酸铵分级沉淀、Sephadex G-100分子筛和DEAE-纤维素离子交换柱层析等分离手段对枯草芽孢杆菌PNG27凝乳酶进行分离纯化，得到电泳纯的凝乳酶。结果表明，SDS-PAGE电泳分析凝乳酶分子质量约为32kDa，比活力由5.5U/mg提高为222.6U/mg，提高了近40倍，回收率为48.8%，酶的纯化倍数为6.8倍，为研究枯草芽孢杆菌凝乳酶的性质提供依据。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
关键字:枯草芽孢杆菌凝乳酶；分离；纯化
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1材料与方法1
1.1材料与试剂 1
1.1.1菌种2
1.1.2培养基2
1.1.3仪器与设备2
1.2方法 2
1.2.1培养方法2
1.2.2粗酶液制备2
1.2.3 Sephadex G-100分子筛层析2
1.2.4 DEAE-纤维素离子交换层析2
1.2.5 SDS-PAGE 电泳2
1.2.6 凝乳酶活力检测2
1.2.7蛋白含量测定3
2结果与分析3
2.1硫酸铵分级沉淀3
2.2 Sephadex G-100分子筛层析3
2.3 DEAE-纤维素离子交换层析4
2.4 SDS-PAGE 电泳分析4
2.5 凝乳酶纯化结果5
3讨论 5
致谢7
参考文献7
枯草芽孢杆菌凝乳酶的分离纯化
引言
传统生产所用的凝乳酶主要是从刚出生的小牛第四胃中提取的活性皱胃酶，随着世界奶酪产业的壮大，凝乳酶的需求量大增，单纯靠屠宰大量小牛来获取凝乳酶显然与现代工业的发展不相符[1]。目前，国际市场上的凝乳酶主要有动物源凝乳酶、植物源凝乳酶以及微生物源凝乳酶。虽然动物源凝乳酶的凝乳活力与蛋白水解能力的比值高，但是动物生长较慢且价格较高，不适应当今发展的需要；植物源凝乳酶蛋白水解能力强，其生产也受时间、地域等条件制约[2]；而微生物源凝乳酶凭借其凝乳活力高、产量大、成本低、制备简单等优 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
点成为当前的研究热点。
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是一种非常重要的产酶菌， 主要原因在于它能够产生和分泌大量的胞外酶。虽然目前枯草芽孢杆菌并不是主要的微生物来源凝乳酶产生菌，但因为其在焙烤食品中有较高凝乳活力，所以运用枯草芽孢杆菌生产凝乳酶的相关研究具有比较深远的意义[3]。丁明亮等对枯草芽孢杆菌产凝乳酶发酵条件通过单因素试验和响应面法进行了优化，得出最优发酵工艺：葡萄糖添加量16.2 g/L（质量浓度）、接种量0.130%（体积分数）、发酵时间120.34 h，所得酶活力(1129.05±74.55)SU/mL[4]。目前对枯草芽孢杆菌生产凝乳酶的研究主要为培养基的优化，而研究其分离纯化的较少。
本研究利用枯草芽孢杆菌PNG27发酵生产凝乳酶，通过硫酸铵分级沉淀，Sephadex G-100分子筛层析和DEAE-纤维素离子交换层析得到纯化的凝乳酶。为进一步研究其酶学性质奠定了基础。
1 材料与方法
1．1 材料与试剂
1．1．1 菌种
枯草芽孢杆菌PNG27，本实验室保存。
1．1．2 培养基
①NA培养基：牛肉浸膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，琼脂18.0 g，蒸馏水1 000 mL，pH=7.0；②BPY培养基：牛肉浸膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，酵母膏5.0 g，NaCl 5.0 g，葡萄糖10.0 g，蒸馏水1 000 mL，pH=7.0；③三角瓶发酵培养基:：脱脂奶粉10.0 g，小麦粉16.0 g，大豆蛋白胨8.0 g，NaCl 10.0 g，蒸馏水1 000 mL，pH=7.0。
1．1．3 仪器与设备
全温摇瓶柜；冷冻离心机；DF-1集热式磁力加热搅拌器：江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；HL-2恒流泵、DBS-100电脑全自动部分收集器：上海沪西分析仪器厂有限公司；UV-2450型紫外分光光度计；7200型分光光度计；数显恒温水浴锅：国华电器有限公司。
1．2 方法
1．2．1 培养方法
从保藏的枯草芽孢杆菌PNG27中挑取部分接到NA斜面，于37℃培养24 h，然后将BPY培养基作为种子培养基，从活化后的菌株斜面上转移菌株至BPY培养基中（接种量为两环），37℃，180 r/ min条件下培养11 h，按4%的接种量接入三角瓶发酵培养基中，装液量200 mL/ 1 000 mL摇瓶，33℃，180 r/ min条件下培养36 h。
1．2．2 粗酶液制备
1 000 ml枯草芽孢杆菌凝乳酶的发酵液经8 000 r/ min 离心10 min，离心温度4℃，收集上清液。将上清液置于磁力搅拌器中搅拌，冰浴条件下，缓慢加入研磨成粉末的硫酸铵，使其饱和度达到20%，4℃静置过夜。8 000 r/ min 离心10 min，离心温度4 ℃，收集上清液。冰浴条件下继续向上清液中缓慢加入研磨成粉末的硫酸铵，使其饱和度达到70%，4℃静置过夜。12 000 r/ min 离心15 min，离心温度4 ℃，弃上清液，沉淀溶于0.05 mol/ L的磷酸钠缓冲液中，4℃透析过夜，超滤浓缩后即得粗酶液。
1．2．3 S *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
ephadex G-100分子筛层析
Sephadex G-100装柱后先用0.05 mol/ L，pH值为6.8的磷酸钠缓冲液平衡，取2 ml粗酶液上柱，用0.05 mol/ L，pH值为6.8的磷酸钠缓冲液洗脱（0.5 ml/ min），检测波长280 nm，收集合并洗脱峰，超滤浓缩后测定酶活力。
1．2．4 DEAE-纤维素离子交换层析
取1 ml Sephadex G-100分离后得到的酶液，采用高盐离子浓度梯度分离纯化蛋白，DEAE-纤维素离子交换层析柱预先用0.05 mol/ L，pH值为6.6的磷酸钠缓冲液平衡，以含有不同NaCl浓度（0.1 mol/ L、0.2 mol/ L、0.3 mol/ L、0.5 mol/ L）的0.05 mol/ L，pH值为6.6的磷酸钠缓冲液进行梯度洗脱（0.5 ml/ min），收集合并吸收峰，超滤浓缩后测定酶活力。
1．2．5 SDS-PAGE 电泳
取40 μL样品与10 μL上样缓冲液混合，沸水浴5 min，5000 r/ min 离心5 min，取20 μL上清进行SDS-PAGE 电泳( 分离胶浓度12%，浓缩胶为3%) 。电泳结束后凝胶用考马斯亮蓝R-250 染色，脱色液脱色。
1．6．6 凝乳酶活力检测
[2] 姜峰, 张兰威. 我国凝乳酶特性及其替代品的研究现状[J]. 食品研究与开发, 2003. 12(6): 3-6.
[3] Shieha C J, Thib L A P, Shih I L. Milk-clotting Enzymes Produced by Culture of Bacillus subtilis natto[J]. Biochemical Engineering Journal, 2009, 43: 85-91.
版权保护: 本文由 hbsrm.com编辑，转载请保留链接: www.hbsrm.com/swgc/spkxygc/529.html
