不同脂肪摄入对老年大鼠肠道微生态的影响
摘要：本实验研究了不同脂肪摄入对老年大鼠肠道微生物的影响，选择12月龄SD雄性大鼠 60只，随机分为5组，分别饲喂大豆油（对照组）、精炼猪油、鱼油、红烧肉油、红烧肉，饲喂3个月后，宰杀取盲肠内容物分析其菌群变化。结果表明，膳食会影响肠道菌群的数量和种类。在门的水平上，厚壁菌门和拟杆菌门是5个组别中最主要的菌群门类，占总细菌单位的85%?94％。相比于其它四组，饲喂大豆油的大鼠的拟杆菌相对丰度较高，而饲喂鱼油的大鼠的变形菌的相对丰度较高。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 动物饲养 2
1.1.1 实验动物及日粮配制2
1.1.2 饲养管理3
1.1.3 样品采集与保存3
1.2 盲肠食糜中菌群多样性分析3
1.2.1 主要仪器和试剂3
1.2.2 盲肠食糜中细菌DNA的提取3
1.2.3 肠道细菌总DNA的质量测定4
1.2.4 16S rDNA PCR扩增4
1.2.5 细菌16S rDNA V4区高通量测序5
2 结果与分析5
2.1 基因组DNA提取结果5
2.2 PCR扩增结果5
2.3 不同脂肪日粮对3个月老年大鼠盲肠内容物微生物数量的影响6
2.4 肠道菌群群落结构的比较分析8
3 讨论9
4 结论9
致谢10
参考文献10
不同脂肪摄入对大鼠肠道微生态的影响
引言
脂肪是人体重要的功能物质，可供给人体热量和必需的脂肪酸，人体所需的脂肪大部分来自与日常饮食。肉中脂肪占有很大比例。许多研究认为动物油脂肪例如猪油，富含饱和脂肪酸，长期食用会影响机体肝脏代谢，引发心血管疾病[14]，推崇食用不饱和脂肪酸含量高的鱼油和植物油。但现实生活中也有相反的例子，如作为中华经典美食的红烧肉。猪肉经过烹饪加工后，蛋白质组成未发生明显变化，但脂肪组成变化较大，不少长寿老人喜食红烧肉，但这些老人的甘油三酯胆固醇都不高，
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
且未发现高脂血症动脉粥样硬化冠心病糖尿病等。不同脂肪经消化道消化吸收，不仅对肝脏代谢影响不同，也会通过改变肠道微生物的构成来影响宿主健康。
肠道拥有人体最庞大的正常菌群，其构成非常复杂，光细菌的种类就超过1000种[3]。它们与宿主间进行物质、能量及基因的交流，与人体构成了超级生物体（superorganism）。随着研究的推进及分子生物技术的发展和应用，近年来研究者对肠道微生物的结构组成有了更深入的认识。Eckburg等[5]研究发现肠道微生物基本可分属于厚壁菌门（Firmicntes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、疣微菌门（Verrucomicrobia）和梭杆菌门（Fusobacteria）六大门，其中拟杆菌门和厚壁菌门为主要要优势菌群。宿主和肠道菌群共同构成的肠道微生态环境维系着宿主的免疫和消化系统，这个系统一旦被破坏就会导致多种疾病[6]。在近几年应用高通量测序对宿主肠道菌群的研究中发现，膳食、宿主基因型、年龄、疾病、益生菌、药物等因素影响着宿主肠道菌群的构成和功能。一些研究指出，膳食对肠道菌群组成结构的影响最大。Zhang等[7]分别对ApoaI基因敲除的小鼠和野生小鼠喂以高脂食物和正常食物，研究它们肠道菌群与宿主基因型和饮食的关系，并采用454焦磷酸测序结果证实：膳食对肠道菌群的影响最大，能够解释受试小鼠约一半以上的肠道菌群差异，因此作者推断膳食是肠道菌群结构的重要决定因素。De Filippo等人[8]研究了欧洲儿童和非洲儿童肠道菌群的结构。通过焦磷酸测序技术发现，非洲儿童饮食结构由大量的高碳水化合物和少量的蛋白质食物构成，而欧洲儿童摄入的动物蛋白较多，导致两组儿童的肠道菌群存在显著差异。非洲儿童的肠道菌群中放线菌门和拟杆菌门的含量要高于欧洲儿童，并且以拟杆菌为优势菌群，以普雷沃氏菌属（Prevotella）和密螺旋菌属（Treponema Genera）为特有菌属 [8]。虽然De Filippo等[6]的研究中存在地区差异和宿主基因型等因素，但是综合实际情况并辅以高质量的焦磷酸测序数据证实，膳食结构为影响肠道菌群结构最主要的因素之一。
此外，Turnbaugh等人[9] 研究发现长期高脂肪饮食的摄入，能破坏肠道的屏障作用，还能导致肠道中两个优势菌群厚壁菌门和拟杆菌门的变化。厚壁菌门在肠道中的主要功能是对碳水化合物和蛋白质进行水解，而拟杆菌门主要作用于类固醇、多糖和胆汁酸的代谢，有助于宿主对多糖的吸收以及蛋白质的合成[1011]。Hildebrand等[12]在对RELMβ基因敲出小鼠和野生鼠从正常饮食切换到高脂肪饮食后发现，拟杆菌门的数量有所减少而厚壁菌门和变形菌门的数量有所增加，作者推测这种变化是由高脂肪饮食引起而不是肥胖本身所引起。Murphy 等[13]通过对肥胖小鼠喂以低脂肪食物，对野生鼠同时喂以高脂肪和低脂肪食物8周作为对照，同样证实了高脂食物摄入后厚壁菌门的含量有所增加而拟杆菌门的含量降低；肠道菌群的构成与获取能量的能力之间的关系比以前认为的更为复杂，肠道菌群构成的改变与高脂肪食物的摄入关系密切，并不是简单的基因诱导肥胖假说能够解释的。长期摄入高脂饮食会导致肠道菌群失调，特别是拟杆菌门含量的减少可能影响宿主对多糖和蛋白质的吸收，进而导致肥胖的产生[14]。
综上所述，膳食不仅是肠道菌群构成的决定性因素之一，还是宿主肠道菌群进行区分的指标。通过膳食的调控可以改善或者调解肠道菌群的构成，进而提高宿主自身的健康。本研究拟用不同脂肪（大豆油、鱼油、猪油、红烧肉油、红烧肉）日粮饲喂老年大鼠，建立与人类最为接近的营养性模型，借助高通量测序等方法探索不同脂肪饮食对老年SD大鼠肠道菌群结构的影响，研究不同脂肪饮食对肠道中哪些细菌有明显的影响作用，从微生态学角度探讨肠道菌群在饮食诱导下肠道微生物区系的动态变化及其原因，为以肠道菌群为靶点进行的膳食营养干预提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 动物饲养
1.1.1 实验动物及日粮配制
选择12月龄雄性SD大鼠，60只，预饲7天后随机分为5组，自由采食和饮水，饲喂期为3月。按照大鼠日粮配方（表1）进行日粮饲料配制。
表1 大鼠日粮配方
Table 1 Diet ingredient composition of the rats
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摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 动物饲养 2
1.1.1 实验动物及日粮配制2
1.1.2 饲养管理3
1.1.3 样品采集与保存3
1.2 盲肠食糜中菌群多样性分析3
1.2.1 主要仪器和试剂3
1.2.2 盲肠食糜中细菌DNA的提取3
1.2.3 肠道细菌总DNA的质量测定4
1.2.4 16S rDNA PCR扩增4
1.2.5 细菌16S rDNA V4区高通量测序5
2 结果与分析5
2.1 基因组DNA提取结果5
2.2 PCR扩增结果5
2.3 不同脂肪日粮对3个月老年大鼠盲肠内容物微生物数量的影响6
2.4 肠道菌群群落结构的比较分析8
3 讨论9
4 结论9
致谢10
参考文献10
不同脂肪摄入对大鼠肠道微生态的影响
引言
脂肪是人体重要的功能物质，可供给人体热量和必需的脂肪酸，人体所需的脂肪大部分来自与日常饮食。肉中脂肪占有很大比例。许多研究认为动物油脂肪例如猪油，富含饱和脂肪酸，长期食用会影响机体肝脏代谢，引发心血管疾病[14]，推崇食用不饱和脂肪酸含量高的鱼油和植物油。但现实生活中也有相反的例子，如作为中华经典美食的红烧肉。猪肉经过烹饪加工后，蛋白质组成未发生明显变化，但脂肪组成变化较大，不少长寿老人喜食红烧肉，但这些老人的甘油三酯胆固醇都不高，
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
且未发现高脂血症动脉粥样硬化冠心病糖尿病等。不同脂肪经消化道消化吸收，不仅对肝脏代谢影响不同，也会通过改变肠道微生物的构成来影响宿主健康。
肠道拥有人体最庞大的正常菌群，其构成非常复杂，光细菌的种类就超过1000种[3]。它们与宿主间进行物质、能量及基因的交流，与人体构成了超级生物体（superorganism）。随着研究的推进及分子生物技术的发展和应用，近年来研究者对肠道微生物的结构组成有了更深入的认识。Eckburg等[5]研究发现肠道微生物基本可分属于厚壁菌门（Firmicntes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、疣微菌门（Verrucomicrobia）和梭杆菌门（Fusobacteria）六大门，其中拟杆菌门和厚壁菌门为主要要优势菌群。宿主和肠道菌群共同构成的肠道微生态环境维系着宿主的免疫和消化系统，这个系统一旦被破坏就会导致多种疾病[6]。在近几年应用高通量测序对宿主肠道菌群的研究中发现，膳食、宿主基因型、年龄、疾病、益生菌、药物等因素影响着宿主肠道菌群的构成和功能。一些研究指出，膳食对肠道菌群组成结构的影响最大。Zhang等[7]分别对ApoaI基因敲除的小鼠和野生小鼠喂以高脂食物和正常食物，研究它们肠道菌群与宿主基因型和饮食的关系，并采用454焦磷酸测序结果证实：膳食对肠道菌群的影响最大，能够解释受试小鼠约一半以上的肠道菌群差异，因此作者推断膳食是肠道菌群结构的重要决定因素。De Filippo等人[8]研究了欧洲儿童和非洲儿童肠道菌群的结构。通过焦磷酸测序技术发现，非洲儿童饮食结构由大量的高碳水化合物和少量的蛋白质食物构成，而欧洲儿童摄入的动物蛋白较多，导致两组儿童的肠道菌群存在显著差异。非洲儿童的肠道菌群中放线菌门和拟杆菌门的含量要高于欧洲儿童，并且以拟杆菌为优势菌群，以普雷沃氏菌属（Prevotella）和密螺旋菌属（Treponema Genera）为特有菌属 [8]。虽然De Filippo等[6]的研究中存在地区差异和宿主基因型等因素，但是综合实际情况并辅以高质量的焦磷酸测序数据证实，膳食结构为影响肠道菌群结构最主要的因素之一。
此外，Turnbaugh等人[9] 研究发现长期高脂肪饮食的摄入，能破坏肠道的屏障作用，还能导致肠道中两个优势菌群厚壁菌门和拟杆菌门的变化。厚壁菌门在肠道中的主要功能是对碳水化合物和蛋白质进行水解，而拟杆菌门主要作用于类固醇、多糖和胆汁酸的代谢，有助于宿主对多糖的吸收以及蛋白质的合成[1011]。Hildebrand等[12]在对RELMβ基因敲出小鼠和野生鼠从正常饮食切换到高脂肪饮食后发现，拟杆菌门的数量有所减少而厚壁菌门和变形菌门的数量有所增加，作者推测这种变化是由高脂肪饮食引起而不是肥胖本身所引起。Murphy 等[13]通过对肥胖小鼠喂以低脂肪食物，对野生鼠同时喂以高脂肪和低脂肪食物8周作为对照，同样证实了高脂食物摄入后厚壁菌门的含量有所增加而拟杆菌门的含量降低；肠道菌群的构成与获取能量的能力之间的关系比以前认为的更为复杂，肠道菌群构成的改变与高脂肪食物的摄入关系密切，并不是简单的基因诱导肥胖假说能够解释的。长期摄入高脂饮食会导致肠道菌群失调，特别是拟杆菌门含量的减少可能影响宿主对多糖和蛋白质的吸收，进而导致肥胖的产生[14]。
综上所述，膳食不仅是肠道菌群构成的决定性因素之一，还是宿主肠道菌群进行区分的指标。通过膳食的调控可以改善或者调解肠道菌群的构成，进而提高宿主自身的健康。本研究拟用不同脂肪（大豆油、鱼油、猪油、红烧肉油、红烧肉）日粮饲喂老年大鼠，建立与人类最为接近的营养性模型，借助高通量测序等方法探索不同脂肪饮食对老年SD大鼠肠道菌群结构的影响，研究不同脂肪饮食对肠道中哪些细菌有明显的影响作用，从微生态学角度探讨肠道菌群在饮食诱导下肠道微生物区系的动态变化及其原因，为以肠道菌群为靶点进行的膳食营养干预提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 动物饲养
1.1.1 实验动物及日粮配制
选择12月龄雄性SD大鼠，60只，预饲7天后随机分为5组，自由采食和饮水，饲喂期为3月。按照大鼠日粮配方（表1）进行日粮饲料配制。
表1 大鼠日粮配方
Table 1 Diet ingredient composition of the rats
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