紫背天葵中APX基因的克隆
紫背天葵中APX基因的克隆[20200509182925]
摘要：抗坏血酸过氧化物酶(APX)是一种在逆境条件下清除细胞内氧自由基、增强植物抗逆性的关键酶。本实验根据已发表与紫背天葵亲缘性比较接近的植物抗坏血酸过氧化物酶基因（APX）的同源保守序列设计简并引物，通过PCR扩增和克隆最终获得了一段长为474 bp的保守片段。在NCBI网站上将获得的保守片段进行同源性比较，数据库分析显示，该序列与其他多种植物的APX基因的氨基酸序列同源性较高，与其他多种植物的APX基因的核苷酸序列同源性则相对较低，但依旧说明所获得的序列为紫背天葵APX 基因保守区序列。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
关键字:APX；紫背天葵；克隆；保守片段
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words2
引言2
1材料与方法3
1.1材料 3
1.1.1实验器材的处理及试剂 3
1.1.2实验仪器 3
1.1.3实验材料 3
1.2 实验方法 3
1.2.1紫背天葵叶片RNA 的提取 3
1.2.2电泳检测 4
1.2.3微量分光光度计测定RNA浓度及纯度4
1.2.4 cDNA第一链的合成4
1.2.5 PCR反应:4
1.2.6凝胶电泳中DNA片段的回收5
1.2.7 DNA片段与克隆载体的连接5
1.2.8大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备6
1.2.9重组质粒DNA的转化6
1.2．10菌液PCR鉴定目的片段6
2结果与分析 7
2.1总RNA浓度和质量 7
2.2引物可用性 8
2.3紫背天葵APX保守区域cDNA序列的克隆9
2.3.1 PCR产物分析9
2.3．2同源性分析10
3结论 11
致谢12
参考文献12
紫背天葵中APX基因克隆
引言
紫背天葵，学名Gynura bicolor D. C，别名紫背菜、两色三七草、红背菜、观音菜，为菊科三七草属多年生宿根草本植物，原产于中国，在广东、海南、福建、四川等地均有分布[ 1]。药学试验表明，紫背天葵性味甘、凉、具有清热解毒、活血止血、降血压、消肿等功效，主治痛经、血崩、咳血、血气亏、创伤出血 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
、溃疡久不收口等[ 2]。因其具有良好的预防和保健效果,受到愈来愈多消费者的喜爱。
干旱和低温等环境胁迫严重影响植物的正常生长发育，使细胞代谢不协调，产生大量伤害自身的活性氧，引起膜脂过氧化、膜蛋白聚合等反应，从而破坏生物膜的结构和功能，损伤植物细胞[3-4]。H2O2是一种主要的活性氧，及时清除 H2O2对于维持植物细胞正常的生理功能非常重要。抗坏血酸过氧化物酶(APX)就是植物进化出来的一种清除植物叶绿体和胞质中H2O2的抗坏血酸-谷胱甘肽循环机制的关键酶[5-6]，它利用抗坏血酸作为电子供体清除植物体内产生的H2O2[7-8]，从而提高植物抵御氧化胁迫能力，增强植物的抗逆性。盐地碱蓬[9]、白桦[10]、黑麦草[11]、番茄[12]等植物的研究已证实 APX 基因在抗氧化胁迫中的重要作用。目前，已有许多植物的 APX基因被克隆，但用于 APX 基因克隆和功能研究的植物大都是正常环境下生长的常见的模式材料，而对于紫背天葵APX 基因的克隆、生物信息学分析及低温胁迫下基因的表达研究报道较少。本实验课题通过以紫背天葵为材料，设计简并引物来扩增出APX基因，作为今后能够进一步研究其在紫背天葵中对生物和非生物胁迫的应答反应机制做铺垫。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验器材及试剂
实验器材：研钵、研棒、药匙、小刀、砧板、2mL 的离心管、200μL 的EP管。
试剂：Tris-HCL溶液、CTAB提取液、SSTE buffer溶液、0.5mol/L EDTA溶液、10%SDS溶液、8mol/L Licl溶液、10%TAE缓冲液、氯仿异戊醇（24:1）、无水乙醇、75%的乙醇、氨苄青霉素、DNA marker、克隆载体pMD19-T Vector、 cDNA反转录试剂盒、PCR试剂盒。
1.1.2 实验仪器
精密电子天平（DJ300 北京赛多利斯仪器系统有限公司 上海）；
恒温磁力搅拌器（85-1 常州国华电器有限公司 常州）；
高速冷冻离心机（GL-20G-Ⅱ 上海安亭科学仪器厂
数显恒温水浴锅（HH-6 常州国华电器有限公司 常州）；
台面式pH/ISE测试仪（Orion86802 上海纳锘仪器有限公司 美国）；
微型旋涡混合仪（XW-80A 上海沪西分析仪器厂有限公司 上海）；
电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9030A 上海益恒实验仪器有限公司 上海）；
电泳仪（DYY-10C 北京市六一仪器厂 北京）
隔水式恒温培养箱（GRP-9160型 上海森信实验仪器有限公司 上海）
PCR仪（2720 Theral Cycler Applied Biosystems）
微量分光光度计（NANODROP 2000 Thermo）
紫外凝胶成像仪（Universal Hood II BIO-RAD）
摇床
1.1.3 实验材料
实验所用材料是新鲜无机械损伤完整的紫背天葵叶片，取叶片的上三分之一部分切碎混合均匀，先用保鲜膜包裹，之后用锡纸 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
包裹，放入液氮中冷冻，之后取出存放在－ 20℃冰箱中备用。
1.2实验方法
1.2.1 紫背天葵叶片总RNA 的提取
在紫背天葵叶片总RNA的提取上，预实验尝试了两种方法：方法一是Trizol法 ；方法二是改良的CTAB提取法。
方法一：Trizol法
(1)取适量已处理冷冻叶片，加液氮研磨成粉末状；
(2)称取0.06-0.1g的粉末，用小钥匙分装到2.0ml无RNA酶的离心管中，在每个离心管中加入1.5mL Trizol，摇匀，室温下静置5min；
(3)每管中加入300μL冷的氯仿，用力振荡15s，然后静置3min；
(4)4℃，12000r/min离心15min，小心取上相；
(5)用750μL冷的异丙醇沉淀水相中的RNA，混匀，室温放置10min；
(6)4℃，12000r/min离心15min，去上清；
(7)每管加入冷的75%乙醇1.5mL清洗沉淀，4℃，12000r/min离心10min，弃上清；
(8)室温晾干沉淀，保证乙醇已经挥发了，加入25μL的DEPC水溶解RNA；
方法二：改良的CTAB提取法
(1)取适量的紫背天葵叶片于研钵中，加液氮研磨成粉末，称取0.1g研磨粉末于已灭菌预冷的2mL离心管中，加入1.2mL65℃预热的CTAB提取液，充分振荡混匀；
PrimeScriptRT Enzyme Mix I 0.5μL
Oligo dT Primer（50 μM） 0.5μL
Random 6 mers（100 μM） 0.5μL
Total RN A 1μL
RNase Free dH2O 5.5μL
反应液配制在冰上进行。反转录反应条件如下：
37℃ 40 min
85℃ 5 min
Marker 1 2 3 4 5 6
摘要：抗坏血酸过氧化物酶(APX)是一种在逆境条件下清除细胞内氧自由基、增强植物抗逆性的关键酶。本实验根据已发表与紫背天葵亲缘性比较接近的植物抗坏血酸过氧化物酶基因（APX）的同源保守序列设计简并引物，通过PCR扩增和克隆最终获得了一段长为474 bp的保守片段。在NCBI网站上将获得的保守片段进行同源性比较，数据库分析显示，该序列与其他多种植物的APX基因的氨基酸序列同源性较高，与其他多种植物的APX基因的核苷酸序列同源性则相对较低，但依旧说明所获得的序列为紫背天葵APX 基因保守区序列。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
关键字:APX；紫背天葵；克隆；保守片段
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words2
引言2
1材料与方法3
1.1材料 3
1.1.1实验器材的处理及试剂 3
1.1.2实验仪器 3
1.1.3实验材料 3
1.2 实验方法 3
1.2.1紫背天葵叶片RNA 的提取 3
1.2.2电泳检测 4
1.2.3微量分光光度计测定RNA浓度及纯度4
1.2.4 cDNA第一链的合成4
1.2.5 PCR反应:4
1.2.6凝胶电泳中DNA片段的回收5
1.2.7 DNA片段与克隆载体的连接5
1.2.8大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备6
1.2.9重组质粒DNA的转化6
1.2．10菌液PCR鉴定目的片段6
2结果与分析 7
2.1总RNA浓度和质量 7
2.2引物可用性 8
2.3紫背天葵APX保守区域cDNA序列的克隆9
2.3.1 PCR产物分析9
2.3．2同源性分析10
3结论 11
致谢12
参考文献12
紫背天葵中APX基因克隆
引言
紫背天葵，学名Gynura bicolor D. C，别名紫背菜、两色三七草、红背菜、观音菜，为菊科三七草属多年生宿根草本植物，原产于中国，在广东、海南、福建、四川等地均有分布[ 1]。药学试验表明，紫背天葵性味甘、凉、具有清热解毒、活血止血、降血压、消肿等功效，主治痛经、血崩、咳血、血气亏、创伤出血 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
、溃疡久不收口等[ 2]。因其具有良好的预防和保健效果,受到愈来愈多消费者的喜爱。
干旱和低温等环境胁迫严重影响植物的正常生长发育，使细胞代谢不协调，产生大量伤害自身的活性氧，引起膜脂过氧化、膜蛋白聚合等反应，从而破坏生物膜的结构和功能，损伤植物细胞[3-4]。H2O2是一种主要的活性氧，及时清除 H2O2对于维持植物细胞正常的生理功能非常重要。抗坏血酸过氧化物酶(APX)就是植物进化出来的一种清除植物叶绿体和胞质中H2O2的抗坏血酸-谷胱甘肽循环机制的关键酶[5-6]，它利用抗坏血酸作为电子供体清除植物体内产生的H2O2[7-8]，从而提高植物抵御氧化胁迫能力，增强植物的抗逆性。盐地碱蓬[9]、白桦[10]、黑麦草[11]、番茄[12]等植物的研究已证实 APX 基因在抗氧化胁迫中的重要作用。目前，已有许多植物的 APX基因被克隆，但用于 APX 基因克隆和功能研究的植物大都是正常环境下生长的常见的模式材料，而对于紫背天葵APX 基因的克隆、生物信息学分析及低温胁迫下基因的表达研究报道较少。本实验课题通过以紫背天葵为材料，设计简并引物来扩增出APX基因，作为今后能够进一步研究其在紫背天葵中对生物和非生物胁迫的应答反应机制做铺垫。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验器材及试剂
实验器材：研钵、研棒、药匙、小刀、砧板、2mL 的离心管、200μL 的EP管。
试剂：Tris-HCL溶液、CTAB提取液、SSTE buffer溶液、0.5mol/L EDTA溶液、10%SDS溶液、8mol/L Licl溶液、10%TAE缓冲液、氯仿异戊醇（24:1）、无水乙醇、75%的乙醇、氨苄青霉素、DNA marker、克隆载体pMD19-T Vector、 cDNA反转录试剂盒、PCR试剂盒。
1.1.2 实验仪器
精密电子天平（DJ300 北京赛多利斯仪器系统有限公司 上海）；
恒温磁力搅拌器（85-1 常州国华电器有限公司 常州）；
高速冷冻离心机（GL-20G-Ⅱ 上海安亭科学仪器厂
数显恒温水浴锅（HH-6 常州国华电器有限公司 常州）；
台面式pH/ISE测试仪（Orion86802 上海纳锘仪器有限公司 美国）；
微型旋涡混合仪（XW-80A 上海沪西分析仪器厂有限公司 上海）；
电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9030A 上海益恒实验仪器有限公司 上海）；
电泳仪（DYY-10C 北京市六一仪器厂 北京）
隔水式恒温培养箱（GRP-9160型 上海森信实验仪器有限公司 上海）
PCR仪（2720 Theral Cycler Applied Biosystems）
微量分光光度计（NANODROP 2000 Thermo）
紫外凝胶成像仪（Universal Hood II BIO-RAD）
摇床
1.1.3 实验材料
实验所用材料是新鲜无机械损伤完整的紫背天葵叶片，取叶片的上三分之一部分切碎混合均匀，先用保鲜膜包裹，之后用锡纸 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
包裹，放入液氮中冷冻，之后取出存放在－ 20℃冰箱中备用。
1.2实验方法
1.2.1 紫背天葵叶片总RNA 的提取
在紫背天葵叶片总RNA的提取上，预实验尝试了两种方法：方法一是Trizol法 ；方法二是改良的CTAB提取法。
方法一：Trizol法
(1)取适量已处理冷冻叶片，加液氮研磨成粉末状；
(2)称取0.06-0.1g的粉末，用小钥匙分装到2.0ml无RNA酶的离心管中，在每个离心管中加入1.5mL Trizol，摇匀，室温下静置5min；
(3)每管中加入300μL冷的氯仿，用力振荡15s，然后静置3min；
(4)4℃，12000r/min离心15min，小心取上相；
(5)用750μL冷的异丙醇沉淀水相中的RNA，混匀，室温放置10min；
(6)4℃，12000r/min离心15min，去上清；
(7)每管加入冷的75%乙醇1.5mL清洗沉淀，4℃，12000r/min离心10min，弃上清；
(8)室温晾干沉淀，保证乙醇已经挥发了，加入25μL的DEPC水溶解RNA；
方法二：改良的CTAB提取法
(1)取适量的紫背天葵叶片于研钵中，加液氮研磨成粉末，称取0.1g研磨粉末于已灭菌预冷的2mL离心管中，加入1.2mL65℃预热的CTAB提取液，充分振荡混匀；
PrimeScriptRT Enzyme Mix I 0.5μL
Oligo dT Primer（50 μM） 0.5μL
Random 6 mers（100 μM） 0.5μL
Total RN A 1μL
RNase Free dH2O 5.5μL
反应液配制在冰上进行。反转录反应条件如下：
37℃ 40 min
85℃ 5 min
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