S.Heidelberg双重PCR快速检测研究
S.Heidelberg双重PCR快速检测研究[20200509175755]
摘要：近年来S.Heidelberg在食品的规模化流通中引起食物中毒的事件并不罕见。传统的血清学分型方法存在着许多缺陷，本研究旨在建立针对S.Heidelberg的双重PCR快速检测反应体系。使用比较基因组学的方法，利用BLAST工具筛选得到S.Heidelberg的特异性基因pHAm8和139-141，结合煮沸法提取DNA。利用pHAm8和139-141建立的双重PCR可以清晰地扩增到相应的目的条带。基因组 DNA 灵敏度检测可以达到 14pg/ul，菌落灵敏度检测可达3.8×10-1CFU。在检测人工污染食品样品实验里，如果人工污染牛奶样品接种起始菌量为 3.8×10-1CFU 时，只需要培养 6h就能检出沙门氏菌。本研究筛选到S.Heidelberg新的特异性基因，并提供了一种快速检测S.Heidelberg的有效方法。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
关键字:沙门氏菌；双重PCR；靶点；筛选
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words 1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.1.1 BLAST软件2
1.1.2 菌株2
1.2 方法 2
1.2.1培养基及主要试剂配方 3
1.2.2 DNA 提取3
1.3筛选S.Heidelberg特异性片段3
1.4 双重PCR引物设计3
1.5双重PCR反应体系 4
1.6双重PCR的特异性 4
1.7 双重PCR灵敏度实验 4
1.7.1基因组DNA灵敏度实验 4
1.7 双重PCR的灵度4
1.7.2菌落灵敏度实验 4
1.8 人工污染实验4
2 结果与分析 4
2．1 BLAST工具筛选的S.Heidelberg特异性靶点 5
2．2 双重PCR检测结果 5
2．3 双重PCR的特异性 6
2．4双重PCR检测的灵敏度6
2. 4.1基因组DNA灵敏度6
2.4.2菌落灵敏度实验 7
2.5评价人工污染实验 7
3 讨论 8
参考文献9
S.Heidelberg双重PCR快速检测研究
引言
引言
沙门氏菌（Salmonella spp.）是重要的食源性致病菌之一，主要通过肉类、奶类、蛋类等食品传播、感染人体，引发伤寒、败血症、急性胃肠炎等病症。虽然大多数食源性疾病为散发性并且通常未得到报告，但 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
是食源性疾病暴发可呈现极大规模。例如 1994 年，美国发生了一次由污染的冰淇淋引起的沙门氏菌病暴发，估计影响 224 000 人[1]。据统计，我国每年发生的细菌性食物中毒事件占食物中毒事件总数的 30％～90％，人数占食物中毒总人数的 60％～90％[2]；而沙门氏菌在引起食物中毒的病原菌中约占40%[3]，在全世界居第一位或第二位[4]。
S.Heidelberg是温、冷血动物肠道保有菌,从这些动物粪便污染饲料,进而污染食品的循环,在世界广泛分布。1952年S.Heidelberg在加拿大只是出现个别病例,而1959～1961年已成为加拿大全国最具代表性的传染源。1985年在中国四川省从人和猪中检出S.Heidelberg。到2002年,S.Heidelberg沙门氏菌在中国的分布及检出程度未见系统报道。而2002年,沈阳出入境检验检疫局微生物实验室从美国进口鸡腿中检出S.Heidelberg。2011年，美国嘉吉公司宣布，该公司召回3600万磅火鸡绞肉产品，因为这些产品可能感染了S.Heidelberg，其被认为致全美76人感染、加州一人死亡。显示出S.Heidelberg有呈现世界分布的趋势。S.Heidelberg的致病性对畜牧业的发展和人民群众的食品安全和身体健康均会造成潜在的危害[5]。
自沙门氏菌首次被鉴定为人类的一种致病原以来，人们对沙门氏菌的检测从未停止过探索。传统的培养方法也是食品微生物学检验沙门氏菌的国家标准，总体可分4个步骤：预增菌，选择性增菌，分离,生化和血清学检测。传统沙门氏菌检测法全过程需耗时至少4~7天,才能得出明确的诊断结果。现代的检测方法主要有两大类：第一类是以免疫学为基础，第二类以核酸为基础的分子生物学。免疫学方法对沙门氏菌的最低检测量已可达到500CFU/g。分子生物学方法分为核酸探针法和聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）法。由于食品样品中沙门氏菌数量很少，不能直接利用核酸探针法来检测，因而这种方法难以同 PCR 方法竞争。
本研究结合水煮法提取快速DNA克服了传统的血清型检测方法耗时、操作繁琐、特异性弱等问题[6]。特异PCR扩增检测以快速、特异、灵敏的优势，已广泛应用于沙门氏菌等食源性致病菌的检测[7-9]。本研究使用比较基因组学的方法，利用BLAST工具筛选S.Heidelberg的特异性基因，为建立特异性检测S.Heidelberg的双重PCR反应体系设计灵敏度高的引物，以达到快速检测食品中S.Heidelberg的目的。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1. 1 BLAST软件
BLAST软件分成五个不同的程序，分别为：blastp(提交蛋白质序列，在蛋白质序列数据库中查序列)、blastn(提交核酸序列，在核酸序列数据库中查找同源序列) 、blastx(提交核酸序列，在蛋白质序列数据库中查找同源序列)、tblastn (提交蛋白质序列，在核酸序列数据库中查找同源序列)、tblastx(提交核酸序列，在核酸序列数据库中查找同源序列)。Windows 操作系统版 BLAST 软件可以直接从 NCBI 网站下载(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/executables/release)。
1. 1. 2 菌 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
株
选择45株沙门氏菌（阳性菌株）及18株非沙门氏菌（阴性菌株）作为实验菌株，其中标准菌株来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）、中国医学细菌保藏管理中心（CMCC）及美国模式培养物集存库（ATCC）。表1
表1实验菌株
1. 2 方法
1. 2. 1培养基及主要试剂配方[10]
LB 培养基（Luria-Bertani 培养基）：称取 10 g 胰蛋白胨，5 g 酵母提取物，10 g氯化钠，加蒸馏水定容至 1000 mL，调 pH 值至 7.5，高压灭菌。LB 固体培养基：液体培养基中每升加 15 g 琼脂粉，高压灭菌。TaqDNA 聚合酶，购自生工生物工程（上海）股份有限公司。dNTP 与分子量标准 100 bp DNA Ladder 购自东胜创新生物科技有限公司。6×上样缓冲液：0.25%溴酚蓝，40%蔗糖水溶液。TE缓冲液：10 mmol/L TrisCl（pH8.0），1 mmol/L EDTA （pH8.0）。高压灭菌后储存于4℃冰箱中。溶菌酶溶液：用10mmol/L TrisCl(PH8.0)溶液将溶菌酶配制成10 μg/mL，并分14装成小份(如1.5mL离心管）保存于-20℃。
摘要：近年来S.Heidelberg在食品的规模化流通中引起食物中毒的事件并不罕见。传统的血清学分型方法存在着许多缺陷，本研究旨在建立针对S.Heidelberg的双重PCR快速检测反应体系。使用比较基因组学的方法，利用BLAST工具筛选得到S.Heidelberg的特异性基因pHAm8和139-141，结合煮沸法提取DNA。利用pHAm8和139-141建立的双重PCR可以清晰地扩增到相应的目的条带。基因组 DNA 灵敏度检测可以达到 14pg/ul，菌落灵敏度检测可达3.8×10-1CFU。在检测人工污染食品样品实验里，如果人工污染牛奶样品接种起始菌量为 3.8×10-1CFU 时，只需要培养 6h就能检出沙门氏菌。本研究筛选到S.Heidelberg新的特异性基因，并提供了一种快速检测S.Heidelberg的有效方法。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
关键字:沙门氏菌；双重PCR；靶点；筛选
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摘要1
关键词1
Abstract1
Key words 1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.1.1 BLAST软件2
1.1.2 菌株2
1.2 方法 2
1.2.1培养基及主要试剂配方 3
1.2.2 DNA 提取3
1.3筛选S.Heidelberg特异性片段3
1.4 双重PCR引物设计3
1.5双重PCR反应体系 4
1.6双重PCR的特异性 4
1.7 双重PCR灵敏度实验 4
1.7.1基因组DNA灵敏度实验 4
1.7 双重PCR的灵度4
1.7.2菌落灵敏度实验 4
1.8 人工污染实验4
2 结果与分析 4
2．1 BLAST工具筛选的S.Heidelberg特异性靶点 5
2．2 双重PCR检测结果 5
2．3 双重PCR的特异性 6
2．4双重PCR检测的灵敏度6
2. 4.1基因组DNA灵敏度6
2.4.2菌落灵敏度实验 7
2.5评价人工污染实验 7
3 讨论 8
参考文献9
S.Heidelberg双重PCR快速检测研究
引言
引言
沙门氏菌（Salmonella spp.）是重要的食源性致病菌之一，主要通过肉类、奶类、蛋类等食品传播、感染人体，引发伤寒、败血症、急性胃肠炎等病症。虽然大多数食源性疾病为散发性并且通常未得到报告，但 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
是食源性疾病暴发可呈现极大规模。例如 1994 年，美国发生了一次由污染的冰淇淋引起的沙门氏菌病暴发，估计影响 224 000 人[1]。据统计，我国每年发生的细菌性食物中毒事件占食物中毒事件总数的 30％～90％，人数占食物中毒总人数的 60％～90％[2]；而沙门氏菌在引起食物中毒的病原菌中约占40%[3]，在全世界居第一位或第二位[4]。
S.Heidelberg是温、冷血动物肠道保有菌,从这些动物粪便污染饲料,进而污染食品的循环,在世界广泛分布。1952年S.Heidelberg在加拿大只是出现个别病例,而1959～1961年已成为加拿大全国最具代表性的传染源。1985年在中国四川省从人和猪中检出S.Heidelberg。到2002年,S.Heidelberg沙门氏菌在中国的分布及检出程度未见系统报道。而2002年,沈阳出入境检验检疫局微生物实验室从美国进口鸡腿中检出S.Heidelberg。2011年，美国嘉吉公司宣布，该公司召回3600万磅火鸡绞肉产品，因为这些产品可能感染了S.Heidelberg，其被认为致全美76人感染、加州一人死亡。显示出S.Heidelberg有呈现世界分布的趋势。S.Heidelberg的致病性对畜牧业的发展和人民群众的食品安全和身体健康均会造成潜在的危害[5]。
自沙门氏菌首次被鉴定为人类的一种致病原以来，人们对沙门氏菌的检测从未停止过探索。传统的培养方法也是食品微生物学检验沙门氏菌的国家标准，总体可分4个步骤：预增菌，选择性增菌，分离,生化和血清学检测。传统沙门氏菌检测法全过程需耗时至少4~7天,才能得出明确的诊断结果。现代的检测方法主要有两大类：第一类是以免疫学为基础，第二类以核酸为基础的分子生物学。免疫学方法对沙门氏菌的最低检测量已可达到500CFU/g。分子生物学方法分为核酸探针法和聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）法。由于食品样品中沙门氏菌数量很少，不能直接利用核酸探针法来检测，因而这种方法难以同 PCR 方法竞争。
本研究结合水煮法提取快速DNA克服了传统的血清型检测方法耗时、操作繁琐、特异性弱等问题[6]。特异PCR扩增检测以快速、特异、灵敏的优势，已广泛应用于沙门氏菌等食源性致病菌的检测[7-9]。本研究使用比较基因组学的方法，利用BLAST工具筛选S.Heidelberg的特异性基因，为建立特异性检测S.Heidelberg的双重PCR反应体系设计灵敏度高的引物，以达到快速检测食品中S.Heidelberg的目的。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1. 1 BLAST软件
BLAST软件分成五个不同的程序，分别为：blastp(提交蛋白质序列，在蛋白质序列数据库中查序列)、blastn(提交核酸序列，在核酸序列数据库中查找同源序列) 、blastx(提交核酸序列，在蛋白质序列数据库中查找同源序列)、tblastn (提交蛋白质序列，在核酸序列数据库中查找同源序列)、tblastx(提交核酸序列，在核酸序列数据库中查找同源序列)。Windows 操作系统版 BLAST 软件可以直接从 NCBI 网站下载(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/executables/release)。
1. 1. 2 菌 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
株
选择45株沙门氏菌（阳性菌株）及18株非沙门氏菌（阴性菌株）作为实验菌株，其中标准菌株来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）、中国医学细菌保藏管理中心
表1实验菌株
1. 2 方法
1. 2. 1培养基及主要试剂配方[10]
LB 培养基（Luria-Bertani 培养基）：称取 10 g 胰蛋白胨，5 g 酵母提取物，10 g氯化钠，加蒸馏水定容至 1000 mL，调 pH 值至 7.5，高压灭菌。LB 固体培养基：液体培养基中每升加 15 g 琼脂粉，高压灭菌。TaqDNA 聚合酶，购自生工生物工程（上海）股份有限公司。dNTP 与分子量标准 100 bp DNA Ladder 购自东胜创新生物科技有限公司
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