甲壳素酶酶解产物分析及酶法生产壳寡糖【字数：8803】
摘 要本文通过超高效液相色谱-质谱联用技术(Ultra-high performance liquid chromatography-mass spectrometry, UPLC-Q-TOF-MS)和DNS比色法，研究甲壳酶酶解产物的成分构成及酶法生产壳寡糖的酶解条件。结果表明发酵液中成分主要为壳二糖、壳三糖、壳四糖、壳五糖和壳六糖，酶解的最适温度为30℃，最适pH为6.5，最适时间为6d，在这些条件下，甲壳素酶的酶活达到4.89U/ml，还原糖含量为12.74μg/ml。
目 录
1. 引言1
1.1甲壳素简介1
1.2利用甲壳素生产壳寡糖的方法1
1.2.1化学法生产壳寡糖1
1.2.2物理法生产壳寡糖1
1.2.3酶法生产壳寡糖1
1.2.4壳寡糖的简介和应用2
1.2.5甲壳素酶的国内外研究现状2
1.3 超高效液相色谱质谱串联（UPLCQTOFMS）技术简介3
1.3.1 UPLCQTOFMS技术在食品中的应用3
1.3.2 UPLCQTOFMS技术在医药中的应用3
1.3.3 UPLCQTOFMS技术在化工和环境中的应用3
2. 材料与方法5
2.1材料与试剂5
2.2仪器与设备5
2.3试验方法5
2.3.1 UPLCQTOFMS技术分析甲壳素酶解产物5
2.3.2 酶活测定的原理及方法6
2.3.3 标准曲线的绘制6
2.3.4 研究发酵温度对甲壳素酶的影响7
2.3.5 研究发酵pH对甲壳素酶的影响7
2.3.6 研究发酵时间对甲壳素酶的影响7
3. 结果与分析9
3.1甲壳素酶解产物分析9
3.1.1超高效液相色谱分析9
3.1.2 质谱分析9
3.2发酵温度对甲壳素酶的影响10
3.3发酵pH对甲壳素酶的影响11
3.4发酵时间对甲壳素酶的影响11
4. 结论13
参考文献14
致谢 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
17
1． 引言
1.1 甲壳素简介
甲壳素又名几丁质，由β1，4 糖苷键连接的N乙酰D葡糖胺单元(GlcNAc)组成，是地球上储量最丰富的天然生物聚合物之一[1]，也是唯一的带正电荷的天然多糖，每年自然界中的储存量超过百亿吨，仅次于纤维素[2]。但甲壳素分子量极大，大多在100万（单位）以上，不溶于水，且难溶于一般的有机溶剂，仅溶于浓的盐酸、硫酸、磷酸等，这就导致了甲壳素的应用难以实现，同时其有关的环境问题也越来越受到人们的重视。
1.2 利用甲壳素生产壳寡糖的方法
目前降解甲壳素生成甲壳低聚糖的方法主要有化学法、物理法和酶法等。
1.2.1 化学法
酸水解法是甲壳素在工业生产中最常用的一种方法。一般甲壳寡糖的制备方法主要是通过先得到壳聚糖的低聚糖，再乙酰化得到甲壳素的低聚糖。甲壳素在浓盐酸中的水解反应速率受温度、寡糖的链长影响较大，但不受离子强度的影响[3]。Barker将甲壳素加到冷的乙酸酐中，浓硫酸做催化剂，室温放置40小时，55℃保温11小时，倒入0℃乙酸钠溶液中，离心取上清，碳酸钠中和，萃取，过滤，浓缩，分离得到系列寡糖[4]。但化学法反应条件难以实现，反应产物难以定性，产品难以稳定，对环境的污染更是难以处理和应对。
1.2.2 物理法
物理法降解甲壳素主要有微波、辐射、超声等方法。微波法降解可通过改变微波强度和降解时间得到不同分子量的寡糖，加入少量等无机盐，还能促进降解速度[5]。物理法虽产出率高，但生产成本高，缺乏经济性，难以实现工业化生产。
1.2.3 酶法
酶法生产壳寡糖即是利用甲壳素酶的作用和反应，在甲壳素酶的作用下，甲壳素可分解成具有水溶性甲壳低聚糖或壳寡糖（COS）。甲壳素酶主要产自微生物，包括芽孢杆菌、链霉菌、粘质沙雷氏菌以及假单胞菌等[69]。多数微生物只有在含有甲壳素等诱导物的培养基中才能产生甲壳素酶，在甲壳素的诱导下，微生物会产生并向胞外分泌甲壳素酶，即胞外酶[10] ，且所产甲壳素酶多是分泌型的。
专一性甲壳素酶酶解法反应温和，产品均一，对环境没有污染，可大量节省生产成本和时间，因此具有很高的经济效益。Tamo等 [11]将来源于放线菌（Streptomyces sp. N174）壳聚糖酶基因在大肠杆菌中表达，异源表达的壳聚糖酶的比酶活达到58.9Ｕ/mＬ。LiXin Kang等[12] 将来源于枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis HD145）的壳聚糖酶基因成功在毕赤酵母中实现异源高效表达，壳聚糖酶的比酶活可达9000Ｕ/ml，表达量高达800mg/ml。虽然离工业化生产的要求还有很大距离，但已经明显比化学法和物理法生产壳寡糖更具有可行性。
1.2.4 壳寡糖的简介和应用
壳寡糖是一种由210个氨基葡萄糖通过β1，4 糖苷键连接的低聚糖。与壳聚糖相比，壳寡糖的分子量低、水溶性好、易吸收、无细胞毒性，具有更广泛的应用前景[13]。
目前已有研究表明，壳寡糖具有抗氧化活性、抗真菌[14]、免疫调节[15]和抑制肿瘤生长[16]等生理活性。抗氧化活性方面，壳寡糖已被证明在体外和体内都具有优异的抗氧化活性[17]。在抗肿瘤作用方面，甲壳寡糖可以通过增加机体免疫，抑制肿瘤细胞生长。Tokoro等[18]报道了壳六糖明显抑制移植到鼠中的MethA瘤细胞。Joen等[19]研究发现分子量500010000的甲壳寡糖对鼠肿瘤细胞生长有着最强的抑制作用。此外在农业生产方面，甲壳寡糖能活化植物细胞，调节植物的生长发育，促进植物对营养物质的吸收和利用，从而提高农作物的产量和质量。滕少辉等[20]研究发现,用几丁寡糖处理小麦、玉米、马铃薯等农作物,可使农作物增产1030%。沈奕等[21]用的甲壳寡糖溶液浸种处理烟草种子能显著提高种子的发芽率和发芽势,且种子体内过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)和苯丙氨酸解氨酶(PLA)活性都有显著提高。王黎明等[22]将甲壳寡糖用叶面喷施和根部浇灌等方式施于茶树,提高了茶叶主要品质因子茶多酚、咖啡碱、可溶性糖、游离氨基酸等的含量,增强了β葡萄糖苷酶的活性,并且使茶叶香气物质的组成成分和含量发生了改变,从而促成茶叶香型的改变。甲壳寡糖对多种植物病原菌有抑制作用,其作用机理并不是直接杀死病原真菌,而是抑制真菌的生长[23]。
目 录
1. 引言1
1.1甲壳素简介1
1.2利用甲壳素生产壳寡糖的方法1
1.2.1化学法生产壳寡糖1
1.2.2物理法生产壳寡糖1
1.2.3酶法生产壳寡糖1
1.2.4壳寡糖的简介和应用2
1.2.5甲壳素酶的国内外研究现状2
1.3 超高效液相色谱质谱串联（UPLCQTOFMS）技术简介3
1.3.1 UPLCQTOFMS技术在食品中的应用3
1.3.2 UPLCQTOFMS技术在医药中的应用3
1.3.3 UPLCQTOFMS技术在化工和环境中的应用3
2. 材料与方法5
2.1材料与试剂5
2.2仪器与设备5
2.3试验方法5
2.3.1 UPLCQTOFMS技术分析甲壳素酶解产物5
2.3.2 酶活测定的原理及方法6
2.3.3 标准曲线的绘制6
2.3.4 研究发酵温度对甲壳素酶的影响7
2.3.5 研究发酵pH对甲壳素酶的影响7
2.3.6 研究发酵时间对甲壳素酶的影响7
3. 结果与分析9
3.1甲壳素酶解产物分析9
3.1.1超高效液相色谱分析9
3.1.2 质谱分析9
3.2发酵温度对甲壳素酶的影响10
3.3发酵pH对甲壳素酶的影响11
3.4发酵时间对甲壳素酶的影响11
4. 结论13
参考文献14
致谢 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
17
1． 引言
1.1 甲壳素简介
甲壳素又名几丁质，由β1，4 糖苷键连接的N乙酰D葡糖胺单元(GlcNAc)组成，是地球上储量最丰富的天然生物聚合物之一[1]，也是唯一的带正电荷的天然多糖，每年自然界中的储存量超过百亿吨，仅次于纤维素[2]。但甲壳素分子量极大，大多在100万（单位）以上，不溶于水，且难溶于一般的有机溶剂，仅溶于浓的盐酸、硫酸、磷酸等，这就导致了甲壳素的应用难以实现，同时其有关的环境问题也越来越受到人们的重视。
1.2 利用甲壳素生产壳寡糖的方法
目前降解甲壳素生成甲壳低聚糖的方法主要有化学法、物理法和酶法等。
1.2.1 化学法
酸水解法是甲壳素在工业生产中最常用的一种方法。一般甲壳寡糖的制备方法主要是通过先得到壳聚糖的低聚糖，再乙酰化得到甲壳素的低聚糖。甲壳素在浓盐酸中的水解反应速率受温度、寡糖的链长影响较大，但不受离子强度的影响[3]。Barker将甲壳素加到冷的乙酸酐中，浓硫酸做催化剂，室温放置40小时，55℃保温11小时，倒入0℃乙酸钠溶液中，离心取上清，碳酸钠中和，萃取，过滤，浓缩，分离得到系列寡糖[4]。但化学法反应条件难以实现，反应产物难以定性，产品难以稳定，对环境的污染更是难以处理和应对。
1.2.2 物理法
物理法降解甲壳素主要有微波、辐射、超声等方法。微波法降解可通过改变微波强度和降解时间得到不同分子量的寡糖，加入少量等无机盐，还能促进降解速度[5]。物理法虽产出率高，但生产成本高，缺乏经济性，难以实现工业化生产。
1.2.3 酶法
酶法生产壳寡糖即是利用甲壳素酶的作用和反应，在甲壳素酶的作用下，甲壳素可分解成具有水溶性甲壳低聚糖或壳寡糖（COS）。甲壳素酶主要产自微生物，包括芽孢杆菌、链霉菌、粘质沙雷氏菌以及假单胞菌等[69]。多数微生物只有在含有甲壳素等诱导物的培养基中才能产生甲壳素酶，在甲壳素的诱导下，微生物会产生并向胞外分泌甲壳素酶，即胞外酶[10] ，且所产甲壳素酶多是分泌型的。
专一性甲壳素酶酶解法反应温和，产品均一，对环境没有污染，可大量节省生产成本和时间，因此具有很高的经济效益。Tamo等 [11]将来源于放线菌（Streptomyces sp. N174）壳聚糖酶基因在大肠杆菌中表达，异源表达的壳聚糖酶的比酶活达到58.9Ｕ/mＬ。LiXin Kang等[12] 将来源于枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis HD145）的壳聚糖酶基因成功在毕赤酵母中实现异源高效表达，壳聚糖酶的比酶活可达9000Ｕ/ml，表达量高达800mg/ml。虽然离工业化生产的要求还有很大距离，但已经明显比化学法和物理法生产壳寡糖更具有可行性。
1.2.4 壳寡糖的简介和应用
壳寡糖是一种由210个氨基葡萄糖通过β1，4 糖苷键连接的低聚糖。与壳聚糖相比，壳寡糖的分子量低、水溶性好、易吸收、无细胞毒性，具有更广泛的应用前景[13]。
目前已有研究表明，壳寡糖具有抗氧化活性、抗真菌[14]、免疫调节[15]和抑制肿瘤生长[16]等生理活性。抗氧化活性方面，壳寡糖已被证明在体外和体内都具有优异的抗氧化活性[17]。在抗肿瘤作用方面，甲壳寡糖可以通过增加机体免疫，抑制肿瘤细胞生长。Tokoro等[18]报道了壳六糖明显抑制移植到鼠中的MethA瘤细胞。Joen等[19]研究发现分子量500010000的甲壳寡糖对鼠肿瘤细胞生长有着最强的抑制作用。此外在农业生产方面，甲壳寡糖能活化植物细胞，调节植物的生长发育，促进植物对营养物质的吸收和利用，从而提高农作物的产量和质量。滕少辉等[20]研究发现,用几丁寡糖处理小麦、玉米、马铃薯等农作物,可使农作物增产1030%。沈奕等[21]用的甲壳寡糖溶液浸种处理烟草种子能显著提高种子的发芽率和发芽势,且种子体内过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)和苯丙氨酸解氨酶(PLA)活性都有显著提高。王黎明等[22]将甲壳寡糖用叶面喷施和根部浇灌等方式施于茶树,提高了茶叶主要品质因子茶多酚、咖啡碱、可溶性糖、游离氨基酸等的含量,增强了β葡萄糖苷酶的活性,并且使茶叶香气物质的组成成分和含量发生了改变,从而促成茶叶香型的改变。甲壳寡糖对多种植物病原菌有抑制作用,其作用机理并不是直接杀死病原真菌,而是抑制真菌的生长[23]。
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