产γ氨基丁酸的乳酸菌的筛选
摘要：本实验是采用微生物发酵法，从传统发酵食品分离得到的377株乳酸菌中，通过分离纯化、纸层析初筛、高效液相色谱复筛等的方法，筛选出了16株产γ-氨基丁酸的菌株，对其中几株产量较高的菌株进行DNA鉴定，发现大部分菌株为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），其中发酵48h后γ-氨基丁酸最大产能为0.545g/L，菌株为M-6-2。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
前言 2
1 材料与方法 3
1．1 实验材料 3
1．1．1 菌株 3
1．1．2 培养基 3
1．1．3 主要试剂 3
1．1．4 主要仪器及设备 3
1．2 主要方法 3
1．2．1 菌株的活化及发酵 3
1．2．2 发酵液的处理 3
1．2．3 产GABA乳酸菌的初筛 3
1．2．4 产GABA乳酸菌的复筛 3
1．2．5 鉴定DNA序列（菌种鉴定） 3
1．2．6 菌株形态观察 4
1．2．7 菌株培养时间曲线 4
2 结果与分析 4
2．1 纸层析初筛结果 4
2．2 高效液相色谱复筛 6
2．2．1 GABA衍生物最大吸收波长的确定 6
2．2．2 菌株液相定量结果 7
2．3 菌株分子生物学鉴定 8
2．4 菌株形态观察 9
2．5 菌株产GABA时间曲线 9
3 讨论 10
致谢 10
参考文献 11
产γ氨基丁酸的乳酸菌的筛选
引言
γ氨基丁酸是其中的一种非蛋白质天然氨基酸，又名4氨基丁酸（4Aminobutyric acid, 4AB, 简称GABA），是L谷氨酸（LGlutamic acid, Glu）经谷氨酸脱羧酶（Glutamate decarboxylase, EC4.1.1.15, 简称GAD或GDC）
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
催化脱酸得到的[1]，表明GABA代谢途径与三羧酸循环有关。
GABA自1950年被发现后，在其后的研究中发现有特殊的生理作用。大量研究表明，GABA是在中枢神经系统中有抑制性的神经递质[2]。这种抑制性功能使其在心血管有着重要的作用，能够降低血压[34]，通过Hayakawa等人的研究表明发酵乳中不含抗血压肽从而证实降血压的功能因子是GABA[5]；林智等人发现无论离体实验还是活体实验，含GABA的茶能降低小白鼠的血压[6]。GABA还能起到治疗及预防癫痫的作用[7]，Tadashi等人研究发现帕金森患者和癫痫病患者脑脊液中GABA的含量低于正常人[8]；彭海峰等人发现癫痫病患者脑中CSFGABA的含量能一定程度反映患者智能水平[9]。GABA能改善脑机能，孙兵等人发现GABA能使猫的慢波睡眠Ⅱ期和快动眼睡眠期的时间延长[10]；Leventhal等人通过对老年猴的大脑视觉皮层实验表明GABA跟脑衰老有关[11]；此外，陆勤发现GABA能起到营养神经的效果[12]。GABA在呼吸系统能起到镇咳效果[1314]。GABA还能对机体起到排毒的作用，有研究发现喂食了含GABA的米胚芽的小白鼠的肾脏基底细胞坏死数量大大的降低、小白鼠的尿素态氮较低、血氨降低，表明GABA能活肾增强肝功能来解毒[15]；Spoerri等人研究证明GABA在体外能解除酒精对细胞的毒性[16]。GABA除了上述功能作用以外，还有其他功能作用，如对生理生殖的影响[1718]。
GABA其天然存在的含量较少，于是学者对其合成来源及富集方法进行了大量的科学研究。总得来说，GABA的制备方法分为化学合成法、植物富集法和微生物发酵法三大类。化学合成法反应速度快、产率高，但由于反应条件苛刻及安全性差，只能应用于工业生产，无法再食品行业推广。植物富集法有植物组织生长代谢富集和离体植物组织应激代谢富集这两种形式[19]，目前研究得比较成熟的是在茶及稻米中富集。津志田藤二郎等人对新鲜茶叶进行一定时间的氮气厌氧处理而发现茶中GABA的含量大幅上升[20]；横田哲治发现发芽的糙米GABA 含量较糙米高出2倍，且是白米8倍左右[21]，之后大量学者对其结论进行验证和优化[22]。另外，其他食物也能富集GABA，如人参[23]、黄芪[24]等。由于植物富集法的GABA含量不足以满足需求，所以研究焦点转为微生物发酵法。因为只要微生物细胞内含有GAD和满足体外存在Glu，那么就能产生GABA。人们早期通过大肠杆菌[25]（Escherichia coli）产生GABA，但其制备的 GABA出于安全性考虑大多用于化工生产，很少用于食品工业。所以，近年来国内外研究学者将研究方向转至用一些食品安全级微生物（Generally Recognized As Safe, GRAS）进行 GABA 的生产及研究，如红曲霉[26]（Monascus）、酵母菌（Yeast）和乳酸菌（Lactic Acid Bacteria, LAB）。红曲霉是一种珍贵的药食同源真菌，孙佰申等人通过筛选及优化工艺使红曲霉GM100产生GABA含量能高达0.33g/L。2004年，Takahashi等人筛选到了产GABA的酿酒酵母（Saccharomy）K701的突变型菌株GAB72，测得其发酵液中GABA浓度为0.043 g/L，比野生菌GABA的产量提高2.1倍。但曲霉和酵母菌的生长周期较长，不适合大规模发酵制备GABA，所以目前更多的是研究乳酸菌。乳酸菌作为一种食品安全级微生物可直接应用在食品以及医疗保健等方面，如泡菜、奶酪、面包和酸奶等食品的生产。乳酸菌本身的生理生化功能[27]也有益于人体健康，己经有很多研究表明乳酸菌具有GAD 酶活性[ 36, 2834]，可以用于催化Glu脱羧生产GABA，如短乳杆菌（Lactobacillus brevis）、 植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）、戊糖乳杆菌（Lactobacillus pentosus）等。乳酸菌因其本身生长周期短、繁殖快、有多种生理功能、安全无害，在食品行业中能有广泛应用。
本研究的目的是从传统发酵食品中分离筛选出产GABA的乳酸菌菌种，不但对其进行鉴定，确定其种属，还要确定其产GABA的能力，为其菌种改良和用于GABA的生产奠定基础。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 菌株
本实验筛选自传统发酵食品如泡菜、波孜等样品中，初步鉴定为乳酸菌（革兰氏染色阳性，触酶阴性）。
1．1．2 培养基
MRS液体培养基：蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏5g、Tween80 1mL、葡萄糖20g、磷酸氢二钾2.62g、柠檬酸氢二铵2g、无水乙酸钠5g、硫酸镁0. 58g、硫酸锰0. 198g、蒸馏水定容至1L。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
前言 2
1 材料与方法 3
1．1 实验材料 3
1．1．1 菌株 3
1．1．2 培养基 3
1．1．3 主要试剂 3
1．1．4 主要仪器及设备 3
1．2 主要方法 3
1．2．1 菌株的活化及发酵 3
1．2．2 发酵液的处理 3
1．2．3 产GABA乳酸菌的初筛 3
1．2．4 产GABA乳酸菌的复筛 3
1．2．5 鉴定DNA序列（菌种鉴定） 3
1．2．6 菌株形态观察 4
1．2．7 菌株培养时间曲线 4
2 结果与分析 4
2．1 纸层析初筛结果 4
2．2 高效液相色谱复筛 6
2．2．1 GABA衍生物最大吸收波长的确定 6
2．2．2 菌株液相定量结果 7
2．3 菌株分子生物学鉴定 8
2．4 菌株形态观察 9
2．5 菌株产GABA时间曲线 9
3 讨论 10
致谢 10
参考文献 11
产γ氨基丁酸的乳酸菌的筛选
引言
γ氨基丁酸是其中的一种非蛋白质天然氨基酸，又名4氨基丁酸（4Aminobutyric acid, 4AB, 简称GABA），是L谷氨酸（LGlutamic acid, Glu）经谷氨酸脱羧酶（Glutamate decarboxylase, EC4.1.1.15, 简称GAD或GDC）
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
催化脱酸得到的[1]，表明GABA代谢途径与三羧酸循环有关。
GABA自1950年被发现后，在其后的研究中发现有特殊的生理作用。大量研究表明，GABA是在中枢神经系统中有抑制性的神经递质[2]。这种抑制性功能使其在心血管有着重要的作用，能够降低血压[34]，通过Hayakawa等人的研究表明发酵乳中不含抗血压肽从而证实降血压的功能因子是GABA[5]；林智等人发现无论离体实验还是活体实验，含GABA的茶能降低小白鼠的血压[6]。GABA还能起到治疗及预防癫痫的作用[7]，Tadashi等人研究发现帕金森患者和癫痫病患者脑脊液中GABA的含量低于正常人[8]；彭海峰等人发现癫痫病患者脑中CSFGABA的含量能一定程度反映患者智能水平[9]。GABA能改善脑机能，孙兵等人发现GABA能使猫的慢波睡眠Ⅱ期和快动眼睡眠期的时间延长[10]；Leventhal等人通过对老年猴的大脑视觉皮层实验表明GABA跟脑衰老有关[11]；此外，陆勤发现GABA能起到营养神经的效果[12]。GABA在呼吸系统能起到镇咳效果[1314]。GABA还能对机体起到排毒的作用，有研究发现喂食了含GABA的米胚芽的小白鼠的肾脏基底细胞坏死数量大大的降低、小白鼠的尿素态氮较低、血氨降低，表明GABA能活肾增强肝功能来解毒[15]；Spoerri等人研究证明GABA在体外能解除酒精对细胞的毒性[16]。GABA除了上述功能作用以外，还有其他功能作用，如对生理生殖的影响[1718]。
GABA其天然存在的含量较少，于是学者对其合成来源及富集方法进行了大量的科学研究。总得来说，GABA的制备方法分为化学合成法、植物富集法和微生物发酵法三大类。化学合成法反应速度快、产率高，但由于反应条件苛刻及安全性差，只能应用于工业生产，无法再食品行业推广。植物富集法有植物组织生长代谢富集和离体植物组织应激代谢富集这两种形式[19]，目前研究得比较成熟的是在茶及稻米中富集。津志田藤二郎等人对新鲜茶叶进行一定时间的氮气厌氧处理而发现茶中GABA的含量大幅上升[20]；横田哲治发现发芽的糙米GABA 含量较糙米高出2倍，且是白米8倍左右[21]，之后大量学者对其结论进行验证和优化[22]。另外，其他食物也能富集GABA，如人参[23]、黄芪[24]等。由于植物富集法的GABA含量不足以满足需求，所以研究焦点转为微生物发酵法。因为只要微生物细胞内含有GAD和满足体外存在Glu，那么就能产生GABA。人们早期通过大肠杆菌[25]（Escherichia coli）产生GABA，但其制备的 GABA出于安全性考虑大多用于化工生产，很少用于食品工业。所以，近年来国内外研究学者将研究方向转至用一些食品安全级微生物（Generally Recognized As Safe, GRAS）进行 GABA 的生产及研究，如红曲霉[26]（Monascus）、酵母菌（Yeast）和乳酸菌（Lactic Acid Bacteria, LAB）。红曲霉是一种珍贵的药食同源真菌，孙佰申等人通过筛选及优化工艺使红曲霉GM100产生GABA含量能高达0.33g/L。2004年，Takahashi等人筛选到了产GABA的酿酒酵母（Saccharomy）K701的突变型菌株GAB72，测得其发酵液中GABA浓度为0.043 g/L，比野生菌GABA的产量提高2.1倍。但曲霉和酵母菌的生长周期较长，不适合大规模发酵制备GABA，所以目前更多的是研究乳酸菌。乳酸菌作为一种食品安全级微生物可直接应用在食品以及医疗保健等方面，如泡菜、奶酪、面包和酸奶等食品的生产。乳酸菌本身的生理生化功能[27]也有益于人体健康，己经有很多研究表明乳酸菌具有GAD 酶活性[ 36, 2834]，可以用于催化Glu脱羧生产GABA，如短乳杆菌（Lactobacillus brevis）、 植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）、戊糖乳杆菌（Lactobacillus pentosus）等。乳酸菌因其本身生长周期短、繁殖快、有多种生理功能、安全无害，在食品行业中能有广泛应用。
本研究的目的是从传统发酵食品中分离筛选出产GABA的乳酸菌菌种，不但对其进行鉴定，确定其种属，还要确定其产GABA的能力，为其菌种改良和用于GABA的生产奠定基础。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 菌株
本实验筛选自传统发酵食品如泡菜、波孜等样品中，初步鉴定为乳酸菌（革兰氏染色阳性，触酶阴性）。
1．1．2 培养基
MRS液体培养基：蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏5g、Tween80 1mL、葡萄糖20g、磷酸氢二钾2.62g、柠檬酸氢二铵2g、无水乙酸钠5g、硫酸镁0. 58g、硫酸锰0. 198g、蒸馏水定容至1L。
版权保护: 本文由 hbsrm.com编辑，转载请保留链接: www.hbsrm.com/swgc/spkxygc/390.html
