南苜蓿全草总黄酮提取及其抑菌作用分析【字数：8528】
本文研究复合酶解法辅助乙醇法提取南苜蓿全草总黄酮的工艺条件，并对其抑菌作用进行分析。在单因素的基础上，采用响应面分析法，优化南苜蓿全草总黄酮的提取工艺。以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌为供试菌，测定南苜蓿全草总黄酮的抑菌活性及最低抑菌浓度（MIC）。结果表明南苜蓿全草总黄酮最优提取工艺条件为复合酶比例（纤维素酶果胶酶）为 7.9:2.1，复合酶用量为 3.5%，复合酶解温度为 38℃，此时南苜蓿全草总黄酮提取率为（1.50±0.3）%。抑菌实验结果表明，南苜蓿全草总黄酮对两种菌都有显著的抑制效果，南苜蓿全草总黄酮对大肠杆菌的最低抑菌浓度为 0.3 mg/mL，对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为 0.4 mg/mL。
Key Words: Medicago polymorpha Linn; total flavonoids; Compound enzymatic hydrolysis; response surface method; antibacterial activity 目录
1.前言1
1.1南苜蓿简介1
1.2 黄酮类化合物的生物活性1
1.3 本研究的目的和意义1
2.实验材料与方法3
2.1实验材料3
2.1.1 原料与试剂3
2.1.2 实验菌种3
2.1.3 培养基3
2.1.4 实验仪器3
2.2 实验方法3
2.2.1南苜蓿预处理3
2.2.2 南苜蓿全草总黄酮的提取方法3
2.2.3 南苜蓿全草总黄酮提取率的测定3
2.2.4 提取南苜蓿总黄酮的工艺研究4
2.2.4.1 单因素实验设计4
2.2.4.2 响应面分析法设计5
2.2.5 抑菌实验6
2.2.5.1菌种活化及菌悬液制备6
2.2.5.2抑菌实验设计6
3.结果与分析7
3.1标准曲线的制作7
3.2单因素实验结果7
3.2.1纤维素酶与果胶酶的比例的影响7
3.2.2 复合酶解温度的影响8
3.2.3 复合酶解时间 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
的影响9
3.2.4 复合酶用量的影响10
3.3 响应面实验结果10
3.3.1 方案设计与结果10
3.3.2 回归方程与方差分析11
3.3.3 响应面分析13
3.3.4 最佳提取方案验证试验14
3.4抑菌实验结果分析14
4.结论15
参考文献16
致谢17
1前言
1.1南苜蓿简介
南苜蓿是豆科苜蓿属的一、二年生草本植物，又称草头、金花菜，主要分布于我国江浙一带[1]。我国有悠久的栽培历史，其对生长环境要求不高，所以其产量很大，而且生长快速。南苜蓿作为一种中药，具有清热凉血，治疗黄疸等多种养生调理作用[2]。
多年来，我国对南苜蓿的利用主要以家畜饲料为主，作为天然保健食品的应用较少[3]。近年来，越来越多的研究人员开始对苜蓿类植物进行探索，逐步重视苜蓿中黄酮类、多糖等有效物质的提取工艺，对苜蓿进行更多方面的利用，开发更多的副产品，提高对苜蓿类植物的利用率[45]。
1.2黄酮类化合物的生物活性
黄酮类化合物又称黄酮体，黄碱素，是植物代谢过程中所产生的一类次级代谢产物。黄酮类化合物是一种天然存在的抗氧化物，可以通过捕获自由基来降低过量自由基对机体的危害[6]。并且黄酮去除自由基的能力与酚羟基的数目有关，数目越多，其去除自由基的能力也就越强[78]。
黄酮类化合物之所以具有一定的抑菌性，是因为黄酮类化合物可以通过破坏微生物细胞壁的完整性，增加细胞膜的通透性，抑制细菌合成核酸，进而影响蛋白质的合成，降低细菌的致病性从而达到抑菌效果[9]。
此外，黄酮类物质也可以通过抗氧化功能，清除体内自由基，改善体内脂质代谢来达到降脂这一效果[10]。
1.3本研究的目的和意义
黄酮类化合物是植物代谢过程中所产生的一种重要的次级代谢产物，它具有抗氧化、抑菌、降低血脂等多方面的生物活性，并且因为其低毒性的特点，成为了许多美容保健产品、抗菌药物、降血脂药物的研究热点。近年来，大量研究发现南苜蓿中含有黄酮、多糖、皂苷等多种生物活性成分[11]。但目前尚未见有关从南苜蓿中提取黄酮的研究，南苜蓿作为一种高产量的大田植物，种植方便，完全能够用更低的价格获得活性产品。因此，针对南苜蓿的综合开发利用前景广阔。
本实验通过复合酶法辅助乙醇法对南苜蓿中的总黄酮进行提取，先进行单因素实验分析，在此基础上，应用响应面探索出南苜蓿总黄酮的最佳提取工艺。最后，测试该工艺条件下提取的黄酮对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度。
该课题为大规模提取南苜蓿黄酮奠定了初步的理论基础，并对南苜蓿黄酮的抑菌效果进行有效论证，为南苜蓿黄酮生产保健产品提供了科学依据。 2实验材料与方法
2.1实验材料
2.1.1 原料与试剂
南苜蓿全草（常熟本地10月产），芦丁标准品，亚硝酸钠，硝酸铝，氢氧化钠，果胶酶，纤维素酶，乙醇。
2.1.2 实验菌种
大肠杆菌、金黄色葡萄球菌，菌种保藏于生物与食品工程学院发酵工程中心。
2.1.3 培养基
LB培养基：胰蛋白胨 10 g，酵母提取物 5 g，氯化钠 10 g，蒸馏水 1 L，pH为 7.27.4。
2.1.4 实验仪器
烘箱，中药粉碎机，20目筛网，精密天平，容量瓶( 1000 mL，100 mL，50 mL），锥形瓶（250 mL），移液管（10 mL，5 mL，1 mL，0.5 mL），25 mL试管，25 mL比色管，抽滤装置，紫外分光光度计，培养皿，水浴锅，高压蒸汽灭菌锅，超净工作台，pH计。
2.2实验方法
2.2.1南苜蓿预处理
南苜蓿去除杂质，挑拣新鲜绿色的南苜蓿全草，置于 70℃恒温烘箱内干燥至恒重，取出用粉碎机粉碎，过 20目筛网，得到南苜蓿全草粉用袋子密封装好放在通风干燥的地方避光保藏，备用。
2.2.2南苜蓿全草总黄酮的提取方法
定量称取干燥后的南苜蓿草粉置于 50 mL容量瓶中，通过控制变量法，在不同的实验条件下，对南苜蓿总黄酮进行提取。先加复合酶液 25 mL，放入水浴锅中酶解，之后放入 80℃水浴锅中灭酶 10 min，取出来后用乙醇定容至刻度，再放入 40℃水浴锅中提取 10 min，取出后用真空抽滤机抽滤，滤液即为含有南苜蓿总黄酮的提取液。取提取液待测，每个实验均做三组平行，取平均值作为最终的实验结果。
Key Words: Medicago polymorpha Linn; total flavonoids; Compound enzymatic hydrolysis; response surface method; antibacterial activity 目录
1.前言1
1.1南苜蓿简介1
1.2 黄酮类化合物的生物活性1
1.3 本研究的目的和意义1
2.实验材料与方法3
2.1实验材料3
2.1.1 原料与试剂3
2.1.2 实验菌种3
2.1.3 培养基3
2.1.4 实验仪器3
2.2 实验方法3
2.2.1南苜蓿预处理3
2.2.2 南苜蓿全草总黄酮的提取方法3
2.2.3 南苜蓿全草总黄酮提取率的测定3
2.2.4 提取南苜蓿总黄酮的工艺研究4
2.2.4.1 单因素实验设计4
2.2.4.2 响应面分析法设计5
2.2.5 抑菌实验6
2.2.5.1菌种活化及菌悬液制备6
2.2.5.2抑菌实验设计6
3.结果与分析7
3.1标准曲线的制作7
3.2单因素实验结果7
3.2.1纤维素酶与果胶酶的比例的影响7
3.2.2 复合酶解温度的影响8
3.2.3 复合酶解时间 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
的影响9
3.2.4 复合酶用量的影响10
3.3 响应面实验结果10
3.3.1 方案设计与结果10
3.3.2 回归方程与方差分析11
3.3.3 响应面分析13
3.3.4 最佳提取方案验证试验14
3.4抑菌实验结果分析14
4.结论15
参考文献16
致谢17
1前言
1.1南苜蓿简介
南苜蓿是豆科苜蓿属的一、二年生草本植物，又称草头、金花菜，主要分布于我国江浙一带[1]。我国有悠久的栽培历史，其对生长环境要求不高，所以其产量很大，而且生长快速。南苜蓿作为一种中药，具有清热凉血，治疗黄疸等多种养生调理作用[2]。
多年来，我国对南苜蓿的利用主要以家畜饲料为主，作为天然保健食品的应用较少[3]。近年来，越来越多的研究人员开始对苜蓿类植物进行探索，逐步重视苜蓿中黄酮类、多糖等有效物质的提取工艺，对苜蓿进行更多方面的利用，开发更多的副产品，提高对苜蓿类植物的利用率[45]。
1.2黄酮类化合物的生物活性
黄酮类化合物又称黄酮体，黄碱素，是植物代谢过程中所产生的一类次级代谢产物。黄酮类化合物是一种天然存在的抗氧化物，可以通过捕获自由基来降低过量自由基对机体的危害[6]。并且黄酮去除自由基的能力与酚羟基的数目有关，数目越多，其去除自由基的能力也就越强[78]。
黄酮类化合物之所以具有一定的抑菌性，是因为黄酮类化合物可以通过破坏微生物细胞壁的完整性，增加细胞膜的通透性，抑制细菌合成核酸，进而影响蛋白质的合成，降低细菌的致病性从而达到抑菌效果[9]。
此外，黄酮类物质也可以通过抗氧化功能，清除体内自由基，改善体内脂质代谢来达到降脂这一效果[10]。
1.3本研究的目的和意义
黄酮类化合物是植物代谢过程中所产生的一种重要的次级代谢产物，它具有抗氧化、抑菌、降低血脂等多方面的生物活性，并且因为其低毒性的特点，成为了许多美容保健产品、抗菌药物、降血脂药物的研究热点。近年来，大量研究发现南苜蓿中含有黄酮、多糖、皂苷等多种生物活性成分[11]。但目前尚未见有关从南苜蓿中提取黄酮的研究，南苜蓿作为一种高产量的大田植物，种植方便，完全能够用更低的价格获得活性产品。因此，针对南苜蓿的综合开发利用前景广阔。
本实验通过复合酶法辅助乙醇法对南苜蓿中的总黄酮进行提取，先进行单因素实验分析，在此基础上，应用响应面探索出南苜蓿总黄酮的最佳提取工艺。最后，测试该工艺条件下提取的黄酮对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度。
该课题为大规模提取南苜蓿黄酮奠定了初步的理论基础，并对南苜蓿黄酮的抑菌效果进行有效论证，为南苜蓿黄酮生产保健产品提供了科学依据。 2实验材料与方法
2.1实验材料
2.1.1 原料与试剂
南苜蓿全草（常熟本地10月产），芦丁标准品，亚硝酸钠，硝酸铝，氢氧化钠，果胶酶，纤维素酶，乙醇。
2.1.2 实验菌种
大肠杆菌、金黄色葡萄球菌，菌种保藏于生物与食品工程学院发酵工程中心。
2.1.3 培养基
LB培养基：胰蛋白胨 10 g，酵母提取物 5 g，氯化钠 10 g，蒸馏水 1 L，pH为 7.27.4。
2.1.4 实验仪器
烘箱，中药粉碎机，20目筛网，精密天平，容量瓶( 1000 mL，100 mL，50 mL），锥形瓶（250 mL），移液管（10 mL，5 mL，1 mL，0.5 mL），25 mL试管，25 mL比色管，抽滤装置，紫外分光光度计，培养皿，水浴锅，高压蒸汽灭菌锅，超净工作台，pH计。
2.2实验方法
2.2.1南苜蓿预处理
南苜蓿去除杂质，挑拣新鲜绿色的南苜蓿全草，置于 70℃恒温烘箱内干燥至恒重，取出用粉碎机粉碎，过 20目筛网，得到南苜蓿全草粉用袋子密封装好放在通风干燥的地方避光保藏，备用。
2.2.2南苜蓿全草总黄酮的提取方法
定量称取干燥后的南苜蓿草粉置于 50 mL容量瓶中，通过控制变量法，在不同的实验条件下，对南苜蓿总黄酮进行提取。先加复合酶液 25 mL，放入水浴锅中酶解，之后放入 80℃水浴锅中灭酶 10 min，取出来后用乙醇定容至刻度，再放入 40℃水浴锅中提取 10 min，取出后用真空抽滤机抽滤，滤液即为含有南苜蓿总黄酮的提取液。取提取液待测，每个实验均做三组平行，取平均值作为最终的实验结果。
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