紫背天葵pod酶特性研究
摘要：本实验以去茎后的紫背天葵叶片为原材料，确定了用于POD提取和测定的最佳缓冲液，研究了温度、pH等因素对酶活的影响。采用单因素实验法，比较了不同缓冲液及pH对提取效果和酶活的影响，对筛选缓冲液提取出的粗酶进行了热稳定性、热钝化、最适作用温度和酸碱耐受性试验。结果显示，该酶最佳提取缓冲液为pH 7.8的磷酸、酶活测定以pH 5.4醋酸缓冲液为优；酶活在40℃以下稳定，60℃随时间延长下降，25min后仍然保留50%的活性，80℃下＜1min即可完全失活；该酶的最适作用温度50℃、pH 5.0。
目录
摘要 3
关键词 3
Abstract 3
Key words 3
1 材料、仪器与方法 4
1.1 材料 4
1.2 仪器与设备 4
1.3 测定方法 4
1.3.1酶活的测定 4
1.3.2最佳提取缓冲液pH的测定 4
1.3.3最佳测定缓冲液pH的测定 4
1.3.4酶的热稳定性 4
1.3.5酶的热钝化性 4
1.3.6酶的最适温度 4
1.3.7酶的酸碱耐受性 4
1.4数据处理与统计 5
2结果与分析 5
2.1最佳提取缓冲液pH的测定 5
2.2最佳测定缓冲液pH的测定 5
2.3酶的热稳定性 6
2.4酶的热钝化性 7
2.5酶的最适温度 7
2.6酶的酸碱耐受性 8
3 讨论 8
致谢 9
参考文献 9
紫背天葵POD酶特性研究
引言
POD是包括果蔬在内植物中普遍存在的一类氧化还原酶类，其是能催化多种反应，以过氧化氢为电子受体催化底物氧化的酶[1]。研究发现，POD酶对水果的衰老有显著地影响[23]，也参与了植物的生理生化过程，在植物的逆境适应性和衰老等方面有影响[4]。侯田莹等则认为POD酶在蔬菜衰老过程中具有清除自由基,减少膜脂氧化的作用[5]。Park等[6]人则实验证明，在植株受到病菌侵染与机械损伤时，过氧化物酶积极地作出反应，
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
使细胞壁交联扩张，并产生大量活性氧，通过形成一个有毒环境来抑制和杀死入侵的病菌。目前对POD酶的其他研究较多，Matsuia等研究微波对山葵 POD 的钝化效果，发现在90℃状态下 POD 彻底失活[7]。有人曾对仁用杏[8]、甜仁山杏[9]、银杏枝条[10]的POD酶活性进行了抗寒性研究。还有前人对于过氧化物酶功效的研究，发现它是过氧化物的分解剂和解毒物，具有清除活性氧，从而保护膜系统不受伤害的作用[11]。
紫背天葵是一种很好的叶类蔬菜，这种特色蔬菜中包含维生素C及铁、镁、铜等元素，其具有抗氧化、抗衰老、清除自由基的功效，因而紫背天葵具有保健作用，被认为是一种典型的药食同源植物[12]，值得深入开发利用 [1314]。本试验通过对该酶不同条件下活性的测定，探讨紫背天葵POD酶特性及原因，为进一步明确该酶的生物学特性提供依据。
1 材料、仪器与方法
1.1材料
试验材料为新鲜的紫背天葵，选择色泽基本一致，无病虫害，无机械伤的叶片为试验材料。
1.2试剂与仪器
1.2.1试剂
磷酸二氢钾，磷酸氢二钾，氢氧化钠，盐酸，愈创木酚，双氧水，蒸馏水
1.2.2仪器
飞鸽牌GL20GII低温冷冻离心机：上海安亭科学仪器总厂
电热恒温水浴锅：江苏南通竹行电热恒温器厂
WFJUV2802PC型紫外可见分光光度计：上海尤尼柯仪器有限公司
1.3 测定指标与方法
1.3.1酶活的测定
取0.5g样品加入6.0ml缓冲液在冰浴混合下研磨，离心（4,1000rpm,30min），倒出上清液即为粗酶液。取2.0mlpH5.4的缓冲液于比色皿中，加入1.0ml的愈创木酚溶液，0.05ml粗酶液，再加入0.1ml的双氧水溶液，摇匀后迅速测定吸光值（A460），每隔30s记录一次，连续测3min[15]。本实验参照了Liu Xuan的方法[16]，以愈创木酚作为底物，添加双氧水等试剂测定酶活性。
1.3.2最佳pH提取缓冲液的测定
分别用pH8.7、7.8、6.4、5.4的缓冲液去提取粗酶，用pH5.4的醋酸缓冲液去测定酶活。
1.3.3最佳pH测定缓冲液的测定
用pH8.7的磷酸缓冲液去提取粗酶，分别用pH8.7、7.8、6.4、5.4的缓冲液去测定酶活。
1.3.4酶的热稳定性
设定20℃、40℃、60℃、80℃这四个温度，将POD粗酶液在相应的温度下分别保温0、3、7、15、25min后，常温下测定酶活性。
1.3.5酶的热钝化性
设定60℃、65℃、70℃、75℃、80℃这五个温度，将POD粗酶液在相应温度下分别保温0、10、20、30min后，常温下测定酶活性。
1.3.6酶的最适温度
设定0℃、10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃等九个温度，将缓冲液和底物溶液保温到相应温度，于该温度下测定酶活性。
1.3.7酶的酸碱耐受性
配制pH为2.2、3.0、4.0、5.0、5.4、6.0、6.4、7.0、7.8、8.0、9.0的各缓冲溶液，取2.0ml各pH缓冲溶液，加入0.05ml的粗酶液，至室温下放置24h，后加入1.0ml愈创木酚和0.1ml双氧水，测定POD活性，以pH5.4为空白对照。
1.4数据处理与统计
每次测定做三组平行实验，取平均值。对获得的数据以Excel进行统计分析。
2.结果与分析
2.1最佳提取缓冲液pH的测定
以不同pH（磷酸、醋酸、硼酸）的提取缓冲液提取的粗酶活力如图1。不同pH的提取缓冲液对紫背天葵POD的酶活有一定差异。pH7.8时有一个最大峰值，活性明显高于其他pH的缓冲液。酶是一种蛋白质,蛋白质在溶液中的溶解性主要与蛋白质分子所带电荷多少有关,蛋白质分子带电荷越多,其溶解性越大,当蛋白质所带净电荷为零时,溶解性最低[17]。溶液的pH是影响蛋白质带电性的主要因素,蛋白质在不同pH环境中所带电荷也不相同。可能POD酶在此pH下溶解度最好，难析出。pH7.8缓冲液提取时酶活最高，而pH6.4与pH8.7次之，pH5.4提取时，酶活较低。这是因为用pH5.4提取时，可能该pH接近酶的等电点，酶的溶解性下降。同时在该pH下,酶的稳定性也较低,提取过程中容易失活。因此,提取酶时,在考虑远离酶等电点的同时,也要注意不同pH下酶的稳定性。
目录
摘要 3
关键词 3
Abstract 3
Key words 3
1 材料、仪器与方法 4
1.1 材料 4
1.2 仪器与设备 4
1.3 测定方法 4
1.3.1酶活的测定 4
1.3.2最佳提取缓冲液pH的测定 4
1.3.3最佳测定缓冲液pH的测定 4
1.3.4酶的热稳定性 4
1.3.5酶的热钝化性 4
1.3.6酶的最适温度 4
1.3.7酶的酸碱耐受性 4
1.4数据处理与统计 5
2结果与分析 5
2.1最佳提取缓冲液pH的测定 5
2.2最佳测定缓冲液pH的测定 5
2.3酶的热稳定性 6
2.4酶的热钝化性 7
2.5酶的最适温度 7
2.6酶的酸碱耐受性 8
3 讨论 8
致谢 9
参考文献 9
紫背天葵POD酶特性研究
引言
POD是包括果蔬在内植物中普遍存在的一类氧化还原酶类，其是能催化多种反应，以过氧化氢为电子受体催化底物氧化的酶[1]。研究发现，POD酶对水果的衰老有显著地影响[23]，也参与了植物的生理生化过程，在植物的逆境适应性和衰老等方面有影响[4]。侯田莹等则认为POD酶在蔬菜衰老过程中具有清除自由基,减少膜脂氧化的作用[5]。Park等[6]人则实验证明，在植株受到病菌侵染与机械损伤时，过氧化物酶积极地作出反应，
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
使细胞壁交联扩张，并产生大量活性氧，通过形成一个有毒环境来抑制和杀死入侵的病菌。目前对POD酶的其他研究较多，Matsuia等研究微波对山葵 POD 的钝化效果，发现在90℃状态下 POD 彻底失活[7]。有人曾对仁用杏[8]、甜仁山杏[9]、银杏枝条[10]的POD酶活性进行了抗寒性研究。还有前人对于过氧化物酶功效的研究，发现它是过氧化物的分解剂和解毒物，具有清除活性氧，从而保护膜系统不受伤害的作用[11]。
紫背天葵是一种很好的叶类蔬菜，这种特色蔬菜中包含维生素C及铁、镁、铜等元素，其具有抗氧化、抗衰老、清除自由基的功效，因而紫背天葵具有保健作用，被认为是一种典型的药食同源植物[12]，值得深入开发利用 [1314]。本试验通过对该酶不同条件下活性的测定，探讨紫背天葵POD酶特性及原因，为进一步明确该酶的生物学特性提供依据。
1 材料、仪器与方法
1.1材料
试验材料为新鲜的紫背天葵，选择色泽基本一致，无病虫害，无机械伤的叶片为试验材料。
1.2试剂与仪器
1.2.1试剂
磷酸二氢钾，磷酸氢二钾，氢氧化钠，盐酸，愈创木酚，双氧水，蒸馏水
1.2.2仪器
飞鸽牌GL20GII低温冷冻离心机：上海安亭科学仪器总厂
电热恒温水浴锅：江苏南通竹行电热恒温器厂
WFJUV2802PC型紫外可见分光光度计：上海尤尼柯仪器有限公司
1.3 测定指标与方法
1.3.1酶活的测定
取0.5g样品加入6.0ml缓冲液在冰浴混合下研磨，离心（4,1000rpm,30min），倒出上清液即为粗酶液。取2.0mlpH5.4的缓冲液于比色皿中，加入1.0ml的愈创木酚溶液，0.05ml粗酶液，再加入0.1ml的双氧水溶液，摇匀后迅速测定吸光值（A460），每隔30s记录一次，连续测3min[15]。本实验参照了Liu Xuan的方法[16]，以愈创木酚作为底物，添加双氧水等试剂测定酶活性。
1.3.2最佳pH提取缓冲液的测定
分别用pH8.7、7.8、6.4、5.4的缓冲液去提取粗酶，用pH5.4的醋酸缓冲液去测定酶活。
1.3.3最佳pH测定缓冲液的测定
用pH8.7的磷酸缓冲液去提取粗酶，分别用pH8.7、7.8、6.4、5.4的缓冲液去测定酶活。
1.3.4酶的热稳定性
设定20℃、40℃、60℃、80℃这四个温度，将POD粗酶液在相应的温度下分别保温0、3、7、15、25min后，常温下测定酶活性。
1.3.5酶的热钝化性
设定60℃、65℃、70℃、75℃、80℃这五个温度，将POD粗酶液在相应温度下分别保温0、10、20、30min后，常温下测定酶活性。
1.3.6酶的最适温度
设定0℃、10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃等九个温度，将缓冲液和底物溶液保温到相应温度，于该温度下测定酶活性。
1.3.7酶的酸碱耐受性
配制pH为2.2、3.0、4.0、5.0、5.4、6.0、6.4、7.0、7.8、8.0、9.0的各缓冲溶液，取2.0ml各pH缓冲溶液，加入0.05ml的粗酶液，至室温下放置24h，后加入1.0ml愈创木酚和0.1ml双氧水，测定POD活性，以pH5.4为空白对照。
1.4数据处理与统计
每次测定做三组平行实验，取平均值。对获得的数据以Excel进行统计分析。
2.结果与分析
2.1最佳提取缓冲液pH的测定
以不同pH（磷酸、醋酸、硼酸）的提取缓冲液提取的粗酶活力如图1。不同pH的提取缓冲液对紫背天葵POD的酶活有一定差异。pH7.8时有一个最大峰值，活性明显高于其他pH的缓冲液。酶是一种蛋白质,蛋白质在溶液中的溶解性主要与蛋白质分子所带电荷多少有关,蛋白质分子带电荷越多,其溶解性越大,当蛋白质所带净电荷为零时,溶解性最低[17]。溶液的pH是影响蛋白质带电性的主要因素,蛋白质在不同pH环境中所带电荷也不相同。可能POD酶在此pH下溶解度最好，难析出。pH7.8缓冲液提取时酶活最高，而pH6.4与pH8.7次之，pH5.4提取时，酶活较低。这是因为用pH5.4提取时，可能该pH接近酶的等电点，酶的溶解性下降。同时在该pH下,酶的稳定性也较低,提取过程中容易失活。因此,提取酶时,在考虑远离酶等电点的同时,也要注意不同pH下酶的稳定性。
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