LactobacillusplantarumJla9产细菌素的分离纯化及抑菌谱研究
LactobacillusplantarumJla9产细菌素的分离纯化及抑菌谱研究[20200509182422]
摘要：本研究的目的是以植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum Jla-9）为研究对象，探究植物乳杆菌中产的细菌素的分离纯化技术及其抑菌能力的鉴定。本研究中对细菌素的分离纯化研究包括三个步骤：硫酸铵沉淀、Sephadex LH-20和R-HPLC纯化。然后以枯草芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、嗜热脂肪地芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌为指示菌，通过其抑菌谱的研究鉴定植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum Jla-9）细菌素的抑菌能力。实验表明，抑菌实验所得平板上都有明显的抑菌圈，故从植物乳杆菌中提取的细菌素对上述的七种指示菌都有明显的抑菌活性。这一实验结果表明该种乳酸菌细菌素对于以上七种芽孢杆菌都有很好的抑菌能力，可应用于食品工业中对芽孢杆菌进行杀菌或作为防腐剂使用。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
关键字:细菌素；分离纯化；抑菌圈
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法3
1.1 材料 3
1.1.1菌种 3
1.1.2培养基3
1.1.3主要试剂3
1.1.4主要仪器3
1.2试验方法3
1.2.1Lactobacillus plantarum Jla-9生长及抑菌物质产生曲 线3
1.2.2 Lactobacillus plantarum Jla-9的分离纯化 3
1.2.2.1 Lactobacillus plantarum Jla-9发酵液的制备 3
1.2.2.2 硫酸铵分级沉淀3
1.2.2.3 Sephadex LH-20纯化 3
1.2.2.4 R-HPLC纯化 4
1.2.3 抗菌蛋白Lactobacillus Plantaricin Jla-9抑菌能力的研 究 4
2 结果与分析 4
2.1Lactobacillus plantarum Jla-9生长及抑菌物质产生曲 线 4
2.2 Lactobacillus plantarum Jla-9分离纯化 5
2.3 Lactobacillus Plantaricin Jla-9抗菌蛋白对芽孢杆菌的抑菌作 用 6
3 讨论 7
致谢8
参考文献9
Lactobacillus plantarum Jla-9产细菌素的分离纯化及抑菌谱研究
食品科学与工程学生 陆 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
文俊
引言
引言：细菌素是某些细菌通过核糖体合成机制产生的一种多肽或前体多肽，具有抑菌活性，可用于提高食品的安全性。随着人们生活水平的提高，对于食品安全，人们有了更高的要求。而细菌素，由于其具有热稳定性，且耐酸、耐低温贮藏[1],并对口感及风味不产生不良影响，可作用于食品以起到防腐抑菌的效果，且无常用的化学防腐剂的不良影响，故具有很高的研究价值。
乳酸菌是指能发酵糖类产生大量乳酸的一类无芽孢，厌氧或兼性厌氧的革兰氏阳性且不产过氧化氢的一类细菌的总称[2]。植物乳杆菌是一种重要的乳酸菌，在食品、青贮饲料和医疗保健方面广受关注[3]。本实验对植物乳杆菌细菌素进行分离纯化，作为其抑菌谱研究的样品原料。
目前已经从自然发酵的乳制品非乳制品发酵剂动植物和人类中分离到的乳杆菌中筛选出了产细菌素的许多乳杆菌菌株[4]。已知的乳杆菌细菌素有plantaricin 系列、sakacin 系列、lactocin 系列等近20 种,它们的分子量生化特性敏感范围及作用方式差异较大。
细菌素是20世纪中期Gratia研究大肠杆菌V菌株抑制V菌株时发现的。Gratia和Fredricq对V菌株产生的抑菌物质进行分离，发现它是一种类似于噬菌体但不能自我复制的物质，Fredricq将其称为大肠杆菌素。Jocob将这类物质称之为细菌素。
目前对细菌素产生菌的研究主要集中在乳酸菌上。国外于乳酸菌素的研究较早，已经从乳酸菌的产物中分离到上百种细菌素。产细菌素的乳酸菌种类包括肉杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、明片株菌属、片球菌属等。国内对其它乳酸菌素报道很少，而对nisin的研究取得了突破性进展，最典型的例子就是nisin，它作为一种安全、无毒、天然的食品防腐剂和抗菌添加剂已被50多个国家和地区广泛应用。迄今为止，国内对细菌素的应用研究主要集中于对植物抗菌蛋白的纯化及在食品防腐剂蛋白的纯化。实际在饲料作为抗生素的替代方面的研究相对比较少。
乳酸菌素已广泛应用于食品工业，在乳制品生产中，乳酸链球菌素已成功地用于干酪、巴氏灭菌干酪、巴氏灭菌奶、罐藏浓缩牛奶、高温灭菌奶、高温处理风味奶、酸奶等。它能有效抑制肉毒梭菌的生长和毒素产生．延长产品的保质期并使其在常温下保存。在肉制品生产中，使用乳酸链球菌素的有罐装火腿、熏猪肉、咸猪肉、香肠、真空包装的新鲜牛肉等。在啤酒和果汁饮料的生产中，Nisin能有效控制乳酸菌和啤酒中的片球菌引起的腐败，不影响啤酒的外观、风味等特性。而且对于生长和发酵阶段的啤酒酵母活率没有影响，在低pH值、酒花物质的环境，Nisin活性不受影响．却能够有效的抑制啤酒中已发现的几乎所有的革兰氏阳性腐败菌，从而提高啤酒的生物稳定性。此外．利用乳酸菌素还可以避免巴氏杀菌所带来的“杀菌味”和“老化味”，从而保持啤酒的新鲜度。
乳酸菌细菌素具有光明的应用前景，在未来的一段时间内，乳酸菌细菌素的研究重点是根据已知蛋白质结构设计全新的氨基酸序列，人工合成新型细菌素或对现有的细菌素进行改造，提高乳酸菌细菌素的应用潜力；利用DNA重组技术合成满足人们要求的活性多肽或蛋白质；提高乳酸菌细菌素产量水平；拓宽乳酸菌细菌素抑菌谱，提高乳酸菌细菌素稳定性；提高乳酸菌细菌素抑菌比活力；探讨细菌素产生菌株的自身免疫性机制。
本次实验研究研究的是植物乳杆菌Lactobacillus plantarum *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
Jla-9细菌素的抑菌能力，采用的指示菌为七种不同的芽孢杆菌，芽孢杆菌经常污染食品，威胁人们的饮食安全，
本实验通过研究该乳酸菌细菌素对芽孢杆菌生长繁殖的抑制能力希望能发现一种可应用于食品的细菌素，抑制食品中芽孢杆菌的生长繁殖起到杀菌和防腐的效果，从而提高食品的安全性。
1 材料与方法
1.1材料
1.1.1 菌种
供试菌种： Lactobacillus plantarum Jla-9
指示菌：枯草芽孢杆菌，多粘类芽孢杆菌，凝结芽孢杆菌，短小芽孢杆菌，巨大芽孢杆菌，嗜热脂肪地芽孢杆菌，蜡样芽孢杆菌为指示菌
1.1.2 培养基
乳酸菌培养基
MRS培养基：牛肉膏10g，酵母膏5g，蛋白胨10g，葡萄糖20g，吐温80 1ml，乙酸钠5g，柠檬酸铵2g，磷酸氢二钾2g，硫酸镁0.1g，硫酸锰0.05g，蒸馏水1L，PH6.2±0.2
指示菌培养基
LB培养基：蛋白胨10g，氯化钠10g，酵母膏5g，蒸馏水1L，PH7.0
1.1.3主要试剂
SephadexLH-20(phamarcia),乙腈、三氯乙酸（TFA）、甲醇均为色谱级
1.1.4 主要仪器
冷冻离心机；UV-2450 分光光度计；RP-HPLC;BS-100A自动分布收集仪；HL-2B数据恒流泵；ABI Procise 494 Protein Sequencer
1.2 试验方法
1.2.1 Lactobacillus plantarum Jla-9生长及抑菌物质产生曲线
摘要：本研究的目的是以植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum Jla-9）为研究对象，探究植物乳杆菌中产的细菌素的分离纯化技术及其抑菌能力的鉴定。本研究中对细菌素的分离纯化研究包括三个步骤：硫酸铵沉淀、Sephadex LH-20和R-HPLC纯化。然后以枯草芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、嗜热脂肪地芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌为指示菌，通过其抑菌谱的研究鉴定植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum Jla-9）细菌素的抑菌能力。实验表明，抑菌实验所得平板上都有明显的抑菌圈，故从植物乳杆菌中提取的细菌素对上述的七种指示菌都有明显的抑菌活性。这一实验结果表明该种乳酸菌细菌素对于以上七种芽孢杆菌都有很好的抑菌能力，可应用于食品工业中对芽孢杆菌进行杀菌或作为防腐剂使用。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
关键字:细菌素；分离纯化；抑菌圈
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法3
1.1 材料 3
1.1.1菌种 3
1.1.2培养基3
1.1.3主要试剂3
1.1.4主要仪器3
1.2试验方法3
1.2.1Lactobacillus plantarum Jla-9生长及抑菌物质产生曲 线3
1.2.2 Lactobacillus plantarum Jla-9的分离纯化 3
1.2.2.1 Lactobacillus plantarum Jla-9发酵液的制备 3
1.2.2.2 硫酸铵分级沉淀3
1.2.2.3 Sephadex LH-20纯化 3
1.2.2.4 R-HPLC纯化 4
1.2.3 抗菌蛋白Lactobacillus Plantaricin Jla-9抑菌能力的研 究 4
2 结果与分析 4
2.1Lactobacillus plantarum Jla-9生长及抑菌物质产生曲 线 4
2.2 Lactobacillus plantarum Jla-9分离纯化 5
2.3 Lactobacillus Plantaricin Jla-9抗菌蛋白对芽孢杆菌的抑菌作 用 6
3 讨论 7
致谢8
参考文献9
Lactobacillus plantarum Jla-9产细菌素的分离纯化及抑菌谱研究
食品科学与工程学生 陆 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
文俊
引言
引言：细菌素是某些细菌通过核糖体合成机制产生的一种多肽或前体多肽，具有抑菌活性，可用于提高食品的安全性。随着人们生活水平的提高，对于食品安全，人们有了更高的要求。而细菌素，由于其具有热稳定性，且耐酸、耐低温贮藏[1],并对口感及风味不产生不良影响，可作用于食品以起到防腐抑菌的效果，且无常用的化学防腐剂的不良影响，故具有很高的研究价值。
乳酸菌是指能发酵糖类产生大量乳酸的一类无芽孢，厌氧或兼性厌氧的革兰氏阳性且不产过氧化氢的一类细菌的总称[2]。植物乳杆菌是一种重要的乳酸菌，在食品、青贮饲料和医疗保健方面广受关注[3]。本实验对植物乳杆菌细菌素进行分离纯化，作为其抑菌谱研究的样品原料。
目前已经从自然发酵的乳制品非乳制品发酵剂动植物和人类中分离到的乳杆菌中筛选出了产细菌素的许多乳杆菌菌株[4]。已知的乳杆菌细菌素有plantaricin 系列、sakacin 系列、lactocin 系列等近20 种,它们的分子量生化特性敏感范围及作用方式差异较大。
细菌素是20世纪中期Gratia研究大肠杆菌V菌株抑制V菌株时发现的。Gratia和Fredricq对V菌株产生的抑菌物质进行分离，发现它是一种类似于噬菌体但不能自我复制的物质，Fredricq将其称为大肠杆菌素。Jocob将这类物质称之为细菌素。
目前对细菌素产生菌的研究主要集中在乳酸菌上。国外于乳酸菌素的研究较早，已经从乳酸菌的产物中分离到上百种细菌素。产细菌素的乳酸菌种类包括肉杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、明片株菌属、片球菌属等。国内对其它乳酸菌素报道很少，而对nisin的研究取得了突破性进展，最典型的例子就是nisin，它作为一种安全、无毒、天然的食品防腐剂和抗菌添加剂已被50多个国家和地区广泛应用。迄今为止，国内对细菌素的应用研究主要集中于对植物抗菌蛋白的纯化及在食品防腐剂蛋白的纯化。实际在饲料作为抗生素的替代方面的研究相对比较少。
乳酸菌素已广泛应用于食品工业，在乳制品生产中，乳酸链球菌素已成功地用于干酪、巴氏灭菌干酪、巴氏灭菌奶、罐藏浓缩牛奶、高温灭菌奶、高温处理风味奶、酸奶等。它能有效抑制肉毒梭菌的生长和毒素产生．延长产品的保质期并使其在常温下保存。在肉制品生产中，使用乳酸链球菌素的有罐装火腿、熏猪肉、咸猪肉、香肠、真空包装的新鲜牛肉等。在啤酒和果汁饮料的生产中，Nisin能有效控制乳酸菌和啤酒中的片球菌引起的腐败，不影响啤酒的外观、风味等特性。而且对于生长和发酵阶段的啤酒酵母活率没有影响，在低pH值、酒花物质的环境，Nisin活性不受影响．却能够有效的抑制啤酒中已发现的几乎所有的革兰氏阳性腐败菌，从而提高啤酒的生物稳定性。此外．利用乳酸菌素还可以避免巴氏杀菌所带来的“杀菌味”和“老化味”，从而保持啤酒的新鲜度。
乳酸菌细菌素具有光明的应用前景，在未来的一段时间内，乳酸菌细菌素的研究重点是根据已知蛋白质结构设计全新的氨基酸序列，人工合成新型细菌素或对现有的细菌素进行改造，提高乳酸菌细菌素的应用潜力；利用DNA重组技术合成满足人们要求的活性多肽或蛋白质；提高乳酸菌细菌素产量水平；拓宽乳酸菌细菌素抑菌谱，提高乳酸菌细菌素稳定性；提高乳酸菌细菌素抑菌比活力；探讨细菌素产生菌株的自身免疫性机制。
本次实验研究研究的是植物乳杆菌Lactobacillus plantarum *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
Jla-9细菌素的抑菌能力，采用的指示菌为七种不同的芽孢杆菌，芽孢杆菌经常污染食品，威胁人们的饮食安全，
本实验通过研究该乳酸菌细菌素对芽孢杆菌生长繁殖的抑制能力希望能发现一种可应用于食品的细菌素，抑制食品中芽孢杆菌的生长繁殖起到杀菌和防腐的效果，从而提高食品的安全性。
1 材料与方法
1.1材料
1.1.1 菌种
供试菌种： Lactobacillus plantarum Jla-9
指示菌：枯草芽孢杆菌，多粘类芽孢杆菌，凝结芽孢杆菌，短小芽孢杆菌，巨大芽孢杆菌，嗜热脂肪地芽孢杆菌，蜡样芽孢杆菌为指示菌
1.1.2 培养基
乳酸菌培养基
MRS培养基：牛肉膏10g，酵母膏5g，蛋白胨10g，葡萄糖20g，吐温80 1ml，乙酸钠5g，柠檬酸铵2g，磷酸氢二钾2g，硫酸镁0.1g，硫酸锰0.05g，蒸馏水1L，PH6.2±0.2
指示菌培养基
LB培养基：蛋白胨10g，氯化钠10g，酵母膏5g，蒸馏水1L，PH7.0
1.1.3主要试剂
SephadexLH-20(phamarcia),乙腈、三氯乙酸（TFA）、甲醇均为色谱级
1.1.4 主要仪器
冷冻离心机；UV-2450 分光光度计；RP-HPLC;BS-100A自动分布收集仪；HL-2B数据恒流泵；ABI Procise 494 Protein Sequencer
1.2 试验方法
1.2.1 Lactobacillus plantarum Jla-9生长及抑菌物质产生曲线
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