多重实时荧光pcr检测血旺中鸭，猪和鸡血液成分
摘要：本实验建立了准确可靠的多重TaqMan实时荧光PCR方法用于鉴别血旺中鸡，鸭和猪血液成分。该方法基于动物细胞核DNA中的特异性位点设计引物和探针，进行实时荧光定量PCR扩增，对自制样本和市售样本进行检测，结果表明其特异性好,各物种的最低检测限为0.15ng，灵敏度达1%。可实现对血旺中三种动物血液成分的鉴别。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1材料与方法4
1.1材料与试剂 4
1.1.1材料 4
1.2仪器与设备4
1.3实验方法4
1.3.1模板DNA的制备4
1.3.2血旺样品的制备5
1.3.3引物与探针的合成5
1.3.4多重TaqMan探针实时荧光定量PCR法特异性分析7
1.3.5多重TaqMan探针实时荧光定量PCR法的检测限和灵敏度分析 Y
1.3.6验证实验和抽样检测7
2结果分析7
2.1样品总DNA的提取7
2.2多重TaqMan探针实时荧光定量PCR法的特异性分析 8
2.3多重TaqMan探针实时荧光定量PCR法的检测限和灵敏度分析 9
2.4多重TaqMan探针实时荧光定量PCR法的验证试验和抽样检测 11
3讨论13
致谢13
参考文献13
多重实时荧光PCR检测血旺中鸭，猪和鸡血液成分
引言
引言
肉的掺假一直是社会关注的热点，而发展快速有效的助手鉴定技术是解决关键。自从Tartaglia[1]等首先报道了用 PCR 方法检测饲料中的牛、羊源性成分至今，以PCR为基础的技术已逐步成为了肉类种属鉴定的主要方法[25]。其中，常规PCR[6]技术指在PCR反应基本组成成分基础上发生聚合酶链反应的技术，同一体系内只有一对引物和单一目的模板，操作简单、快速相比于荧光定量PCR法，对设备要求不高，成本更低廉；多重PCR[7]指在传统的常规PCR基础上，于同一体系中加入多对特异性引物，对多个
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DNA模板或同一模板的不同区域扩增出多个目的片段，由于多重PCR能够实现同时扩增多个目标基因,并且扩增产物是由于自己片段大小不一,通过琼脂糖凝胶电泳进行区分,具有降低成本、提高效率、节省时间的优点；限制性片段长度多态性PCR技术[8]，即PCRRFLP，是PCR技术和RFLP技术联合应用。该方法通过设计适当的引物，扩增一段含有特定限制性内切酶酶切位点的DNA片段，经酶切和琼脂糖凝胶电泳，得到特异性的条带，以鉴别不同基因型；随机扩增多态性PCR，即RAPDPCR，是RAPD技术与PCR技术的联合应用。该技术以PCR技术为基础，设计一系列（通常数百个）互不相同的随机排列碱基顺序的寡核苷酸单链（通常为10聚体）为引物，对目的基因片段进行PCR扩增，聚丙烯酰胺或琼脂糖电泳分离，经EB染色或放射自显影来检测PCR产物，以观察DNA片段的多态性；实时荧光定量PCR技术[9]是在常规PCR反应体系中加入荧光基团，根据荧光信号的强度，利用标准曲线、Ct值等对未知模板进行定量分析的方法。
近年来，实时荧光PCR技术是研究热点，其中TaqMan探针技术和SYBR GreenⅠ染料技术应用最为广泛。前者的原理是根据在PCR扩增时，荧光标记探针被降解，发出荧光信号，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成的完全同步，通过监测系统来定量；后者的原理是于SYBR荧光染料特异性地插入到DNA双链之后发射荧光信号，使得荧光信号与PCR产物同步增加，同样通过荧光监测系统来定量。荧光定量PCR技术可以在定性的基础上，达到定量检测的要求。与其他PCR方法相比，在PCR技术的高特异性、高灵敏度的基础上，同时做出定量检测，简便可靠，是鉴别肉类的实用技术。由于PCR反应及其敏感，会受到残留的DNA提取试剂和加工原料的影响，因此要特别注意防止实验的假阴性，在体系中加入一条扩增内标是有效手段，何玮玲[10]等建立含有扩增内标（IAC，Internal amplification control）的用于食品中猪肉和鸡肉成分鉴别的 Taqman 探针实时荧光 PCR 检测方法，结果显示含有扩增内标的 Taqman 探针实时荧光 PCR 体系能有效地进行食品中猪肉和鸡肉成分的快速检测，非目标物种在 40 个循环内均无出现扩增，检出限均为 0.5 ng DNA；该体系对鲜肉和熟肉来源的 DNA 模板检测无显著差异；对市售食品样本的鉴别验证了方法的实用价值。
本实验中，我们把多重PCR和实时荧光PCR结合起来，以猪的细胞核基因βactin 基因（beta actin gene），鸡的细胞核基因转化生长因子基因（transforming growth factor gene）和鸭的白细胞介素2 mRNA基因（interleukin2 mRNA gene）为靶序列，建立了用于鉴别血旺中猪鸡鸭三种动物血液成分的多重实时荧光PCR方法，可实现对三个物种的同时鉴别。
1 材料与方法
1．1 材料与试剂
1．1．1 材料
新鲜鸡血，鸭血采自农贸市场，新鲜猪血采自屠宰场。驴肉、牛肉、兔肉、鹅肉、鱼、山羊肉、绵羊肉、均购于南京超市，用前均储存在－20℃冰箱。
1．1．2 试剂
酚氯仿方法所用主要试剂：自制STE（0.1mol/LNacl+10mmol/LTrisHCL、pH8.0+1mmol/L EDTA）；SDS（20%）；Tris饱和酚；Tris饱和酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）；氯仿∶异戊醇（24∶1）；无水乙醇；NaAc（pH=5.2）；70%乙醇；洗脱剂TE。
血液基因组DNA提取试剂盒（DP318） 天根生化科技(北京)有限公司；
血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒（DP304） 天根生化科技(北京)有限公司；
植物基因组DNA提取试剂盒 天根生化科技(北京)有限公司；
Premix Ex Taq 宝生物工程(大连)有限公司；
引物和探针合成、人工全基因合成 上海辉睿生物科技有限公司完成；
1．2 仪器与设备
MLX206迷你离心机 美国Crystal公司；
TG16WS台式高速离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；
MB102恒温振荡金属浴 杭州博日科技有限公司；
NanoDrop2000微量核酸蛋白分析仪 美国热电公司；
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1材料与方法4
1.1材料与试剂 4
1.1.1材料 4
1.2仪器与设备4
1.3实验方法4
1.3.1模板DNA的制备4
1.3.2血旺样品的制备5
1.3.3引物与探针的合成5
1.3.4多重TaqMan探针实时荧光定量PCR法特异性分析7
1.3.5多重TaqMan探针实时荧光定量PCR法的检测限和灵敏度分析 Y
1.3.6验证实验和抽样检测7
2结果分析7
2.1样品总DNA的提取7
2.2多重TaqMan探针实时荧光定量PCR法的特异性分析 8
2.3多重TaqMan探针实时荧光定量PCR法的检测限和灵敏度分析 9
2.4多重TaqMan探针实时荧光定量PCR法的验证试验和抽样检测 11
3讨论13
致谢13
参考文献13
多重实时荧光PCR检测血旺中鸭，猪和鸡血液成分
引言
引言
肉的掺假一直是社会关注的热点，而发展快速有效的助手鉴定技术是解决关键。自从Tartaglia[1]等首先报道了用 PCR 方法检测饲料中的牛、羊源性成分至今，以PCR为基础的技术已逐步成为了肉类种属鉴定的主要方法[25]。其中，常规PCR[6]技术指在PCR反应基本组成成分基础上发生聚合酶链反应的技术，同一体系内只有一对引物和单一目的模板，操作简单、快速相比于荧光定量PCR法，对设备要求不高，成本更低廉；多重PCR[7]指在传统的常规PCR基础上，于同一体系中加入多对特异性引物，对多个
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$
DNA模板或同一模板的不同区域扩增出多个目的片段，由于多重PCR能够实现同时扩增多个目标基因,并且扩增产物是由于自己片段大小不一,通过琼脂糖凝胶电泳进行区分,具有降低成本、提高效率、节省时间的优点；限制性片段长度多态性PCR技术[8]，即PCRRFLP，是PCR技术和RFLP技术联合应用。该方法通过设计适当的引物，扩增一段含有特定限制性内切酶酶切位点的DNA片段，经酶切和琼脂糖凝胶电泳，得到特异性的条带，以鉴别不同基因型；随机扩增多态性PCR，即RAPDPCR，是RAPD技术与PCR技术的联合应用。该技术以PCR技术为基础，设计一系列（通常数百个）互不相同的随机排列碱基顺序的寡核苷酸单链（通常为10聚体）为引物，对目的基因片段进行PCR扩增，聚丙烯酰胺或琼脂糖电泳分离，经EB染色或放射自显影来检测PCR产物，以观察DNA片段的多态性；实时荧光定量PCR技术[9]是在常规PCR反应体系中加入荧光基团，根据荧光信号的强度，利用标准曲线、Ct值等对未知模板进行定量分析的方法。
近年来，实时荧光PCR技术是研究热点，其中TaqMan探针技术和SYBR GreenⅠ染料技术应用最为广泛。前者的原理是根据在PCR扩增时，荧光标记探针被降解，发出荧光信号，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成的完全同步，通过监测系统来定量；后者的原理是于SYBR荧光染料特异性地插入到DNA双链之后发射荧光信号，使得荧光信号与PCR产物同步增加，同样通过荧光监测系统来定量。荧光定量PCR技术可以在定性的基础上，达到定量检测的要求。与其他PCR方法相比，在PCR技术的高特异性、高灵敏度的基础上，同时做出定量检测，简便可靠，是鉴别肉类的实用技术。由于PCR反应及其敏感，会受到残留的DNA提取试剂和加工原料的影响，因此要特别注意防止实验的假阴性，在体系中加入一条扩增内标是有效手段，何玮玲[10]等建立含有扩增内标（IAC，Internal amplification control）的用于食品中猪肉和鸡肉成分鉴别的 Taqman 探针实时荧光 PCR 检测方法，结果显示含有扩增内标的 Taqman 探针实时荧光 PCR 体系能有效地进行食品中猪肉和鸡肉成分的快速检测，非目标物种在 40 个循环内均无出现扩增，检出限均为 0.5 ng DNA；该体系对鲜肉和熟肉来源的 DNA 模板检测无显著差异；对市售食品样本的鉴别验证了方法的实用价值。
本实验中，我们把多重PCR和实时荧光PCR结合起来，以猪的细胞核基因βactin 基因（beta actin gene），鸡的细胞核基因转化生长因子基因（transforming growth factor gene）和鸭的白细胞介素2 mRNA基因（interleukin2 mRNA gene）为靶序列，建立了用于鉴别血旺中猪鸡鸭三种动物血液成分的多重实时荧光PCR方法，可实现对三个物种的同时鉴别。
1 材料与方法
1．1 材料与试剂
1．1．1 材料
新鲜鸡血，鸭血采自农贸市场，新鲜猪血采自屠宰场。驴肉、牛肉、兔肉、鹅肉、鱼、山羊肉、绵羊肉、均购于南京超市，用前均储存在－20℃冰箱。
1．1．2 试剂
酚氯仿方法所用主要试剂：自制STE（0.1mol/LNacl+10mmol/LTrisHCL、pH8.0+1mmol/L EDTA）；SDS（20%）；Tris饱和酚；Tris饱和酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）；氯仿∶异戊醇（24∶1）；无水乙醇；NaAc（pH=5.2）；70%乙醇；洗脱剂TE。
血液基因组DNA提取试剂盒（DP318） 天根生化科技(北京)有限公司；
血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒（DP304） 天根生化科技(北京)有限公司；
植物基因组DNA提取试剂盒 天根生化科技(北京)有限公司；
Premix Ex Taq 宝生物工程(大连)有限公司；
引物和探针合成、人工全基因合成 上海辉睿生物科技有限公司完成；
1．2 仪器与设备
MLX206迷你离心机 美国Crystal公司；
TG16WS台式高速离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；
MB102恒温振荡金属浴 杭州博日科技有限公司；
NanoDrop2000微量核酸蛋白分析仪 美国热电公司；
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