桃果实成熟过程中蛋白酶活性变化
摘要：以‘霞脆’和‘霞辉-8’桃果实为试材，研究不同温度下成熟衰老过程中蛋白酶、丝氨酸蛋白酶和caspase活性的变化。结果表明：桃果实成熟前期蛋白酶活性有一个小的增加，常温成熟过程中蛋白酶活性持续上升。利用专一性酶抑制剂检测到桃果实成熟过程中的丝氨酸蛋白酶、caspase两种蛋白酶，结果显示，丝氨酸蛋白酶和caspase的活性具有相似的变化趋势，即在采收或稍早时达到最高值，常温条件下随果实的成熟衰老缓慢而持续下降，丝氨酸蛋白酶出现最大值的时间稍早于caspase。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1 材料与方法2
1.1 材料及处理2
1.1.1 样品采集2
1.1.2 ‘霞脆’处理方法2
1.1.3‘霞辉8’处理方法2
1.2 CAT、POD、SOD活性测定2
1.2.1 过氧化氢酶的提取和活性测量2
1.2.2 过氧化物酶的提取和活性测定3
1.2.3 超氧化物歧化酶活性3
1.3 蛋白酶活性的测定3
1.3.1 粗酶液提取3
1.3.2 总蛋白酶活性测定3
1.3.3 丝氨酸蛋白酶和caspase活性测定3
1.4 数据处理4
2 结果与分析4
2.1 CAT、POD、SOD活性变化4
2.2 桃果实成熟过程中总蛋白酶活性变化4
2.3 桃果实成熟过程中丝氨酸蛋白酶活性的变化5
2.4 桃果实成熟过程中caspase活性的变化5
3 讨论6
3.1 桃果实成熟衰老过程中蛋白酶活性的变化6
3.2 不同品种桃果实蛋白酶活性变化6
3.3 桃果实成熟衰老与PCD的关系7
致谢7
参考文献8
桃果实成熟过程中蛋白酶活性变化
引言
桃(Amygdalus Persica．Batsch)属于蔷薇科(Rosaceae)李属(Prunus)桃亚属(Amygdalu
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
s L)，原产于我国西部及中亚一带，主要分布于我国黄河及长江流域。桃果实以其皮薄肉厚、营养丰富等优点而深受国内外消费者喜爱。桃属于典型呼吸跃变型果实，果实成熟期处高温季节，采后生理代谢旺盛，后熟迅速，易失去商品性，造成大量的经济损失[1]。
研究者普遍认为，许多酶的活性增强促成果实成熟、完熟、衰老等一系列变化[2]。多种植物的成熟衰老过程与蛋白质的变化紧密相关，蛋白酶在植物细胞程序性死亡(Programmed Cell Death，PCD)和成熟衰老中均起重要作用[3]。植物的细胞凋亡与细胞增殖共同精确调节机体正常生长发育和内环境稳定，精确的调控机制涉及复杂蛋白酶级联反应过程，其中半胱氨酸蛋白酶(cysteine aspartic acid specific protease，caspase)是最重要的调节酶[4,5]。Caspase属于天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白酶家族，半胱氨酸蛋白酶切割其作用底物而留下1个天冬氨酸残基，在细胞凋亡的启动和执行过程中起关键性作用。正常情况下caspase酶以无活性的酶原(proenzymes)形式存在，激活以后才可以发挥作用，形成级联反应，将凋亡信号一级级传到凋亡底物[6]。在植物某些涉及细胞程序化死亡的发育阶段中，能否检测到caspase类似活性可作为判断植物细胞是否发生PCD的辅助指标[7]。丝氨酸蛋白酶是内肽酶的一种，种类极多，广泛分布于植物中。研究表明，丝氨酸蛋白酶广泛参与植物衰老、木质素合成、发芽、细胞组织分化、程序化细胞死亡、蛋白质降解与加工等生理过程。运用分子生物学手段研究发现，植物中PCD与木质部的分化、豌豆子房的衰老、花组织的退化、叶衰老和花衰老等过程中不断提高的丝氨酸蛋白酶基因表达相关联[8]。
研究表明，果实衰老源于活性氧的积累，正常情况下细胞内存在的酶促和非酶促两大类活性氧清除系统使得活性氧的产生和清除维持着动态平衡，而一旦活性氧清除系统的清除能力下降，使机体内活性氧积累，就会对果实造成毒害而直接导致果实的衰老。因而研究活性氧代谢与果实成熟衰老的关系对采后果实贮藏具也有一定的意义[9]。
目前，还没有对桃果实成熟过程中蛋白酶的活性变化以及蛋白酶的种类的研究报道。本研究中以硬质果肉的‘霞脆’以及软质果肉的‘霞辉8’两种具有代表性的桃子品种为试材，对其果实成熟衰老过程中蛋白酶的活性和丝氨酸蛋白酶、caspase两种蛋白酶的活性进行了测定和分析，辅助检测了三种保护性酶活性变化，旨在从蛋白酶角度研究桃果实成熟衰老的机理，为进一步延长桃果实贮藏期提供理论指导。
1 材料与方法
1．1 材料及处理
1.1.1样品采集
供试桃品种为‘霞脆’和‘霞辉8’，于2014年6~7月分批采自江苏省农业科学院。采收后立即运回实验室，剔除病果、伤果，选取大小相近果实。
1.1.2‘霞脆’处理方法
桃果实成熟前15天采摘7~8个果实，编为1组；桃果实成熟前6天采摘7~8个果实，编为2组。桃果实成熟时采摘，分别取7~8个果实进行编组，编号3~6组于20℃(相对湿度在95%以上) 分别贮藏0、7、14、19d。以上6组样品分别取果肉并切成小块，用液氮快速冻结后分装于聚乙烯薄膜塑料袋中，于80℃超低温冰箱保存备用。
1.1.3‘霞辉8’处理方法
桃果实成熟前7天采摘7~8个果实，编为1组；桃果实成熟前2天采摘7~8个果实，编为2组。桃果实成熟时采摘，分别取7~8个果实进行编组，编号3~7组，于20℃(相对湿度在95%以上)分别贮藏0、2、4、6、8d。以上7组样品取样处理方法同‘霞脆’。
1.2 CAT、POD、SOD活性测定
1.2.1过氧化氢酶(CATalase, CAT)的提取和活性测量
取少量样品于冰冷的研钵内捣碎，液氮研磨成粉，精确称量2.0g于离心管中，加入6mL 经4℃预冷的50mmolL1(pH7.8)的磷酸缓冲液，4000rmin1(4℃)离心15min，上清液即为粗酶液，5℃下保存，保存时间不超过24h。
向1.9mL蒸馏水中加入0.1ml酶粗提液摇匀，再加入1.0mL0.2%的H2O2，立即以蒸馏水为参比测定240 nm处的吸光值，并从加入H2O2时开始计时，30s测定一次，连续测定3min，以ΔOD240g1FWmin1作为酶活性单位。
1.2.2过氧化物酶(Peroxidase，POD)的提取和活性测定
按照朱广廉等[10]的方法加以改进。取少量样品于冰冷的研钵内捣碎，液氮研磨成粉，精确称量1.0g于离心管中，加入6mL 经4℃预冷的50mmolL1 (pH8.7)的硼酸硼砂缓冲液，10000rmin(4℃)离心30min，上清液即为粗酶液，5℃下保存，保存时间不超过24h。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1 材料与方法2
1.1 材料及处理2
1.1.1 样品采集2
1.1.2 ‘霞脆’处理方法2
1.1.3‘霞辉8’处理方法2
1.2 CAT、POD、SOD活性测定2
1.2.1 过氧化氢酶的提取和活性测量2
1.2.2 过氧化物酶的提取和活性测定3
1.2.3 超氧化物歧化酶活性3
1.3 蛋白酶活性的测定3
1.3.1 粗酶液提取3
1.3.2 总蛋白酶活性测定3
1.3.3 丝氨酸蛋白酶和caspase活性测定3
1.4 数据处理4
2 结果与分析4
2.1 CAT、POD、SOD活性变化4
2.2 桃果实成熟过程中总蛋白酶活性变化4
2.3 桃果实成熟过程中丝氨酸蛋白酶活性的变化5
2.4 桃果实成熟过程中caspase活性的变化5
3 讨论6
3.1 桃果实成熟衰老过程中蛋白酶活性的变化6
3.2 不同品种桃果实蛋白酶活性变化6
3.3 桃果实成熟衰老与PCD的关系7
致谢7
参考文献8
桃果实成熟过程中蛋白酶活性变化
引言
桃(Amygdalus Persica．Batsch)属于蔷薇科(Rosaceae)李属(Prunus)桃亚属(Amygdalu
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
s L)，原产于我国西部及中亚一带，主要分布于我国黄河及长江流域。桃果实以其皮薄肉厚、营养丰富等优点而深受国内外消费者喜爱。桃属于典型呼吸跃变型果实，果实成熟期处高温季节，采后生理代谢旺盛，后熟迅速，易失去商品性，造成大量的经济损失[1]。
研究者普遍认为，许多酶的活性增强促成果实成熟、完熟、衰老等一系列变化[2]。多种植物的成熟衰老过程与蛋白质的变化紧密相关，蛋白酶在植物细胞程序性死亡(Programmed Cell Death，PCD)和成熟衰老中均起重要作用[3]。植物的细胞凋亡与细胞增殖共同精确调节机体正常生长发育和内环境稳定，精确的调控机制涉及复杂蛋白酶级联反应过程，其中半胱氨酸蛋白酶(cysteine aspartic acid specific protease，caspase)是最重要的调节酶[4,5]。Caspase属于天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白酶家族，半胱氨酸蛋白酶切割其作用底物而留下1个天冬氨酸残基，在细胞凋亡的启动和执行过程中起关键性作用。正常情况下caspase酶以无活性的酶原(proenzymes)形式存在，激活以后才可以发挥作用，形成级联反应，将凋亡信号一级级传到凋亡底物[6]。在植物某些涉及细胞程序化死亡的发育阶段中，能否检测到caspase类似活性可作为判断植物细胞是否发生PCD的辅助指标[7]。丝氨酸蛋白酶是内肽酶的一种，种类极多，广泛分布于植物中。研究表明，丝氨酸蛋白酶广泛参与植物衰老、木质素合成、发芽、细胞组织分化、程序化细胞死亡、蛋白质降解与加工等生理过程。运用分子生物学手段研究发现，植物中PCD与木质部的分化、豌豆子房的衰老、花组织的退化、叶衰老和花衰老等过程中不断提高的丝氨酸蛋白酶基因表达相关联[8]。
研究表明，果实衰老源于活性氧的积累，正常情况下细胞内存在的酶促和非酶促两大类活性氧清除系统使得活性氧的产生和清除维持着动态平衡，而一旦活性氧清除系统的清除能力下降，使机体内活性氧积累，就会对果实造成毒害而直接导致果实的衰老。因而研究活性氧代谢与果实成熟衰老的关系对采后果实贮藏具也有一定的意义[9]。
目前，还没有对桃果实成熟过程中蛋白酶的活性变化以及蛋白酶的种类的研究报道。本研究中以硬质果肉的‘霞脆’以及软质果肉的‘霞辉8’两种具有代表性的桃子品种为试材，对其果实成熟衰老过程中蛋白酶的活性和丝氨酸蛋白酶、caspase两种蛋白酶的活性进行了测定和分析，辅助检测了三种保护性酶活性变化，旨在从蛋白酶角度研究桃果实成熟衰老的机理，为进一步延长桃果实贮藏期提供理论指导。
1 材料与方法
1．1 材料及处理
1.1.1样品采集
供试桃品种为‘霞脆’和‘霞辉8’，于2014年6~7月分批采自江苏省农业科学院。采收后立即运回实验室，剔除病果、伤果，选取大小相近果实。
1.1.2‘霞脆’处理方法
桃果实成熟前15天采摘7~8个果实，编为1组；桃果实成熟前6天采摘7~8个果实，编为2组。桃果实成熟时采摘，分别取7~8个果实进行编组，编号3~6组于20℃(相对湿度在95%以上) 分别贮藏0、7、14、19d。以上6组样品分别取果肉并切成小块，用液氮快速冻结后分装于聚乙烯薄膜塑料袋中，于80℃超低温冰箱保存备用。
1.1.3‘霞辉8’处理方法
桃果实成熟前7天采摘7~8个果实，编为1组；桃果实成熟前2天采摘7~8个果实，编为2组。桃果实成熟时采摘，分别取7~8个果实进行编组，编号3~7组，于20℃(相对湿度在95%以上)分别贮藏0、2、4、6、8d。以上7组样品取样处理方法同‘霞脆’。
1.2 CAT、POD、SOD活性测定
1.2.1过氧化氢酶(CATalase, CAT)的提取和活性测量
取少量样品于冰冷的研钵内捣碎，液氮研磨成粉，精确称量2.0g于离心管中，加入6mL 经4℃预冷的50mmolL1(pH7.8)的磷酸缓冲液，4000rmin1(4℃)离心15min，上清液即为粗酶液，5℃下保存，保存时间不超过24h。
向1.9mL蒸馏水中加入0.1ml酶粗提液摇匀，再加入1.0mL0.2%的H2O2，立即以蒸馏水为参比测定240 nm处的吸光值，并从加入H2O2时开始计时，30s测定一次，连续测定3min，以ΔOD240g1FWmin1作为酶活性单位。
1.2.2过氧化物酶(Peroxidase，POD)的提取和活性测定
按照朱广廉等[10]的方法加以改进。取少量样品于冰冷的研钵内捣碎，液氮研磨成粉，精确称量1.0g于离心管中，加入6mL 经4℃预冷的50mmolL1 (pH8.7)的硼酸硼砂缓冲液，10000rmin(4℃)离心30min，上清液即为粗酶液，5℃下保存，保存时间不超过24h。
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