霞晖5号”果实成熟期间GPX基因的克隆
霞晖5号”果实成熟期间GPX基因的克隆[20200509183602]
摘要：谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GPX）是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物酶类，是植物体中清除氧自由基的一种主要酶类，与植物抗逆性密切相关。本实验利用RT-PCR与RACE相结合的方法，从“霞晖5号”桃中克隆了GPX基因全长序列，实际所得基因全长923bp，开放阅读框为714bp，编码237个氨基酸。序列分析表明，该基因具有GPX家族典型的保守结构域，与其他植物的谷胱甘肽过氧化物酶基因相比，具有较高的相似性。
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关键字:桃果实；谷胱甘肽过氧化物酶；克隆；结构特性
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
1 材料与方法 2
1.1 材料 2
1.1.1 供试材料 2
1.1.2 实验器材及试剂 2
1.1.3 实验仪器 2
1.2实验方法 2
1.2.1 引物设计 2
1.2.2 “霞晖5号”桃子总RNA的提取 3
1.2.3 总RNA的质量检测 3
1.2.4 反转录cDNA第一链的合成 3
1.2.5 PCR扩增 4
1.2.6 PCR产物目的片段回收 4
1.2.7 目的片段与克隆载体的连接 4
1.2.8 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备 4
1.2.9 大肠杆菌的转化 5
1.2.10 菌液PCR检测 5
1.2.11目的片段的序列测定 5
1.2.12 5’-RACE和3’-RACE扩增 5
1.2.13 3’、5’端基因测序 6
1.2.14 全长序列拼接 6
1.2.15 GPX全长序列的生物信息学分析 6
2 结果与分析 6
2.1 “霞晖5号”总RNA提取纯度与浓度检测 6
2.2 “霞晖5号”中GPX基因全长序列拼接 7
2.3 GPX全长序列的生物信息学分析 8
2.3.1 Ppa GPX基因的外显子-内含子结构 8
2.3.2 分子结构特性 8
2.3.3 同源性分析 9
3 讨论与结论 9
致谢 9
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/> 参考文献 10
“霞晖5号”果实成熟期间GPX基因的克隆
引言
桃是我国最重要的核果，也是江苏省最主要的时鲜水果。研究发现逆境胁迫使作物体内产生大量活性氧（Reactiveoxygen species，ROS），是其对作物产生不良影响的重要机制[1]。在正常生理条件下，植物体内ROS的含量通过植物体内的各种抗氧化途径调控并维持在一定水平。当植物受到外界环境的胁迫时，会诱导产生过量的 ROS。植物体内失衡的ROS水平会扰乱机体的稳态同时会使机体内的重要生命物质发生氧化，导致蛋白的团聚、脂质的过氧化、DNA 的损失等。
植物体在长期的进化中逐渐发展出一整套应对环境胁迫的机制，及时清除体内过多的ROS，调节失衡的内环境。清除机制包括酶促和非酶促两类。酶促系统主要包括 SOD（superoxide dismutase）、APX（ascorbate peroxidase）、CAT（catalyse）、GPX（glutathione peroxidase）；非酶促系统包括抗坏血酸、谷胱甘肽、维生素E等[2]。
谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）是酶促清除机制中的关键酶类，通过催化过氧化氢和脂质过氧化物还原来保护细胞膜免受氧化损伤[3]。最初开展植物体内GPX的研究是从烟草的叶片里克隆了与动物依赖硒的GPX有较高同源性的cDNA[4]，后来陆续在其他作物如柑橘、拟南芥、番茄、水稻[5-8] 等高等植物中陆续分离了此类基因并开展了深入的研究。
与动物GPX不同，迄今还未发现含硒的植物GPX[9]。植物基因组GPX核苷酸序列携带的是一个半胱氨酸残基，替代了动物基因组GPX核苷酸UGA终止密码子处插入的硒代半胱氨酸。动物含硒代半胱氨酸残基的GPX有较强的催化活性，而植物中多数为半胱氨酸，这大大降低了GPX在植物中的催化作用[10]。
近年来，从衣藻和高等植物中也分离得到类似硒代半肤氨酸残基的GPX基因，并从蛋白水平上证实了该酶的催化活性[11, 12]。后来从萌发的大麦和芦荟中纯化了一个16kD的四聚体含硒蛋白[13]，但无直接证据表明其分子结构特征。有人在研究柑橘体内的GPX时，用硒代半肤氨酸残基取代了半胱氨酸残基，却未出现类似哺乳动物GPX的活性[14]。因此，对植物GPX的结构与功能认识仍十分有限。
虽然目前大量的GPX基因被克隆，但是对桃GPX的研究相对较少。本实验以“霞晖5号”桃GPX基因为研究目标，克隆得到GPX基因的cDNA全长，以期为桃抗逆基因工程奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试材料
实验采用的水蜜桃果实（品种：霞辉5号）于2013年6月采自江苏省农科院桃园，采后立即运回实验室，充分散去田间热后，选择果形整齐、大小均匀一致、无病虫害、无机械损伤且成熟度一致的果实作为实验材料。
削去桃果实赤道部分果皮，切取赤道上的果肉，切碎后混匀，用保鲜膜包裹后，再用锡箔纸包裹，置于液氮中冷冻后于-20℃冰箱贮藏。
1.1.2 实验器材及试剂
研钵、研棒、钥匙、小刀、离心管、EP管、枪头、烧杯等。
氨苄青霉素购自南京寿德公司，Trizol,DNA marker，克隆载体pMD19-T Vector、 cDNA反 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
转录试剂盒、PCR试剂盒均购自TaKaRa BIOTECHNOLOGY公司，试剂盒均置于－20℃冰箱中放置。
1.1.3 实验仪器
精密电子天平（DJ300 北京赛多利斯仪器系统有限公司 上海）；
恒温磁力搅拌器（85-1 常州国华电器有限公司 常州）；
高速冷冻离心机（GL-20G-Ⅱ 上海安亭科学仪器厂
数显恒温水浴锅（HH-6 常州国华电器有限公司 常州）；
微型旋涡混合仪（XW-80A 上海沪西分析仪器厂有限公司 上海）；
电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9030A 上海益恒实验仪器有限公司 上海）；
紫外-可见分光光度计（WFJ UV-2802 PC 尤尼柯(上海)仪器有限公司 上海）；
电泳仪（DYY-10C 北京市六一仪器厂 北京）；
隔水式恒温培养箱（GRP-9160型 上海森信实验仪器有限公司 上海）；
PCR仪（2720 Theral Cycler Applied Biosystems）。
1.2实验方法
1.2.1 引物设计
从GDR(
cDNA第一链的合成按TaKaRa公司的PrimeScriptTM RT reagent Kit(Perfect Real Time)试剂盒说明书进行操作。具体步骤如下：
总体积 10μL
16℃过夜。
1.2.8 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备
摘要：谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GPX）是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物酶类，是植物体中清除氧自由基的一种主要酶类，与植物抗逆性密切相关。本实验利用RT-PCR与RACE相结合的方法，从“霞晖5号”桃中克隆了GPX基因全长序列，实际所得基因全长923bp，开放阅读框为714bp，编码237个氨基酸。序列分析表明，该基因具有GPX家族典型的保守结构域，与其他植物的谷胱甘肽过氧化物酶基因相比，具有较高的相似性。
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关键字:桃果实；谷胱甘肽过氧化物酶；克隆；结构特性
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
1 材料与方法 2
1.1 材料 2
1.1.1 供试材料 2
1.1.2 实验器材及试剂 2
1.1.3 实验仪器 2
1.2实验方法 2
1.2.1 引物设计 2
1.2.2 “霞晖5号”桃子总RNA的提取 3
1.2.3 总RNA的质量检测 3
1.2.4 反转录cDNA第一链的合成 3
1.2.5 PCR扩增 4
1.2.6 PCR产物目的片段回收 4
1.2.7 目的片段与克隆载体的连接 4
1.2.8 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备 4
1.2.9 大肠杆菌的转化 5
1.2.10 菌液PCR检测 5
1.2.11目的片段的序列测定 5
1.2.12 5’-RACE和3’-RACE扩增 5
1.2.13 3’、5’端基因测序 6
1.2.14 全长序列拼接 6
1.2.15 GPX全长序列的生物信息学分析 6
2 结果与分析 6
2.1 “霞晖5号”总RNA提取纯度与浓度检测 6
2.2 “霞晖5号”中GPX基因全长序列拼接 7
2.3 GPX全长序列的生物信息学分析 8
2.3.1 Ppa GPX基因的外显子-内含子结构 8
2.3.2 分子结构特性 8
2.3.3 同源性分析 9
3 讨论与结论 9
致谢 9
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
/> 参考文献 10
“霞晖5号”果实成熟期间GPX基因的克隆
引言
桃是我国最重要的核果，也是江苏省最主要的时鲜水果。研究发现逆境胁迫使作物体内产生大量活性氧（Reactiveoxygen species，ROS），是其对作物产生不良影响的重要机制[1]。在正常生理条件下，植物体内ROS的含量通过植物体内的各种抗氧化途径调控并维持在一定水平。当植物受到外界环境的胁迫时，会诱导产生过量的 ROS。植物体内失衡的ROS水平会扰乱机体的稳态同时会使机体内的重要生命物质发生氧化，导致蛋白的团聚、脂质的过氧化、DNA 的损失等。
植物体在长期的进化中逐渐发展出一整套应对环境胁迫的机制，及时清除体内过多的ROS，调节失衡的内环境。清除机制包括酶促和非酶促两类。酶促系统主要包括 SOD（superoxide dismutase）、APX（ascorbate peroxidase）、CAT（catalyse）、GPX（glutathione peroxidase）；非酶促系统包括抗坏血酸、谷胱甘肽、维生素E等[2]。
谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）是酶促清除机制中的关键酶类，通过催化过氧化氢和脂质过氧化物还原来保护细胞膜免受氧化损伤[3]。最初开展植物体内GPX的研究是从烟草的叶片里克隆了与动物依赖硒的GPX有较高同源性的cDNA[4]，后来陆续在其他作物如柑橘、拟南芥、番茄、水稻[5-8] 等高等植物中陆续分离了此类基因并开展了深入的研究。
与动物GPX不同，迄今还未发现含硒的植物GPX[9]。植物基因组GPX核苷酸序列携带的是一个半胱氨酸残基，替代了动物基因组GPX核苷酸UGA终止密码子处插入的硒代半胱氨酸。动物含硒代半胱氨酸残基的GPX有较强的催化活性，而植物中多数为半胱氨酸，这大大降低了GPX在植物中的催化作用[10]。
近年来，从衣藻和高等植物中也分离得到类似硒代半肤氨酸残基的GPX基因，并从蛋白水平上证实了该酶的催化活性[11, 12]。后来从萌发的大麦和芦荟中纯化了一个16kD的四聚体含硒蛋白[13]，但无直接证据表明其分子结构特征。有人在研究柑橘体内的GPX时，用硒代半肤氨酸残基取代了半胱氨酸残基，却未出现类似哺乳动物GPX的活性[14]。因此，对植物GPX的结构与功能认识仍十分有限。
虽然目前大量的GPX基因被克隆，但是对桃GPX的研究相对较少。本实验以“霞晖5号”桃GPX基因为研究目标，克隆得到GPX基因的cDNA全长，以期为桃抗逆基因工程奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试材料
实验采用的水蜜桃果实（品种：霞辉5号）于2013年6月采自江苏省农科院桃园，采后立即运回实验室，充分散去田间热后，选择果形整齐、大小均匀一致、无病虫害、无机械损伤且成熟度一致的果实作为实验材料。
削去桃果实赤道部分果皮，切取赤道上的果肉，切碎后混匀，用保鲜膜包裹后，再用锡箔纸包裹，置于液氮中冷冻后于-20℃冰箱贮藏。
1.1.2 实验器材及试剂
研钵、研棒、钥匙、小刀、离心管、EP管、枪头、烧杯等。
氨苄青霉素购自南京寿德公司，Trizol,DNA marker，克隆载体pMD19-T Vector、 cDNA反 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
转录试剂盒、PCR试剂盒均购自TaKaRa BIOTECHNOLOGY公司，试剂盒均置于－20℃冰箱中放置。
1.1.3 实验仪器
精密电子天平（DJ300 北京赛多利斯仪器系统有限公司 上海）；
恒温磁力搅拌器（85-1 常州国华电器有限公司 常州）；
高速冷冻离心机（GL-20G-Ⅱ 上海安亭科学仪器厂
数显恒温水浴锅（HH-6 常州国华电器有限公司 常州）；
微型旋涡混合仪（XW-80A 上海沪西分析仪器厂有限公司 上海）；
电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9030A 上海益恒实验仪器有限公司 上海）；
紫外-可见分光光度计（WFJ UV-2802 PC 尤尼柯(上海)仪器有限公司 上海）；
电泳仪（DYY-10C 北京市六一仪器厂 北京）；
隔水式恒温培养箱（GRP-9160型 上海森信实验仪器有限公司 上海）；
PCR仪（2720 Theral Cycler Applied Biosystems）。
1.2实验方法
1.2.1 引物设计
从GDR(
cDNA第一链的合成按TaKaRa公司的PrimeScriptTM RT reagent Kit(Perfect Real Time)试剂盒说明书进行操作。具体步骤如下：
总体积 10μL
16℃过夜。
1.2.8 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备
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