基于电子鼻对水果主要腐败微生物的早期判别
基于电子鼻对水果主要腐败微生物的早期判别[20200509182515]
摘要：为了实现电子鼻对水果中常见腐败菌的早期判别，在PDA培养基上分别接种灰葡萄孢霉、根霉和炭疽菌3种水果主要病原菌，以无菌水处理为对照，利用 PEN3型电子鼻每12h提取病原菌的气味，同时利用气质联用技术（GC-MS）分析其挥发性组分。结果表明，12h后，主成分分析能够区分炭疽组和空白对照组；24h后，处理组和对照组能够完全区分，且病原菌种类也可以较好区分。通过SPSS软件进行神经网络判别，建模组的总体正确率达97.00％，验证组的总体正确率达97.20％。气质联用技术结果表明病原菌早期离体培养阶段挥发性物质的变化主要体现在烃类、醇类及酯类。本研究结果为电子鼻技术检测水果早期病害及区分水果采后感染不同腐败菌提供了理论基础。
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关键字:电子鼻；腐败菌；早期判别；气质联用
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 2
1 材料与方法 2
1.1 试验材料 2
1.1.1 培养基 2
1.1.2 病原菌 3
1.2 试验仪器 3
1.3 试验方法 3
1.3.1菌悬液的制备与接种 3
1.3.2 传感器响应值测定 3
1.3.3 气质联用法测定挥发性物质 3
1.3.4 数据处理 3
2 结果及分析 3
2.1 电子鼻检测腐败菌气味的可行性分析 3
2.1.1 CK组的响应值变化 4
2.1.2 灰霉组的响应值变化 5
2.1.3 根霉组的响应值变化 5
2.1.4 炭疽组的响应值变化 5
2.2 不同病原菌处理组和CK组的PDA培养基对照 5
2.3 不同病原菌处理组和CK组的传感器响应值主成分分析 6
2.4 神经网络判别 7
2.5 气相质谱联用法检测结果分析 8
3 结论 9
致谢 10
参考文献: 10
基于电子鼻对水果主要腐败微生物的早期判别
引言
引言
水果是人们日常生活中不可缺少的食品之一，它含有丰富的碳水化合物、有机酸、维生素及无机盐，是人类重要的营养源。也正是由于新鲜水果含有高浓度的糖分和其它营养物质，以及适合微生物生长的理想水活性，同时其较低的pH值特别适合真菌生长，果实易潜入多种真菌而肉眼不易检出[1]。腐败微生物在繁殖过程中产生大量有毒物质 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
，易导致水果食用品质降低，加速腐烂变质过程，缩短了货架期，造成巨大经济损失。因此，微生物控制是水果质量安全控制中的关键问题[2]。
水果采后常见的致腐菌有灰葡萄孢霉（Botrytis cinerea）、根霉（Rhizopus sp.）、炭疽菌（Colletotrichum sp.）等[3]。目前常用的微生物检测方法大致包括分离培养鉴定法、生化鉴定法、酶联免疫吸附法（ELISA）、DNA 杂交和定量 PCR （Quantitative polymerase chain reaction，QPCR）等方法[4-5]。传统的微生物检验方法灵敏度高，费用低，但检测所需时间较长且工作量庞大。现代免疫学和分子生物学特异性好效率高，但一般样品预处理过程比较复杂，且较难达到实时检测的目的[6]。
电子鼻是模仿人和动物的鼻子，用于分析、识别、检测复杂气味和挥发性成分的新型仪器。电子鼻根据对不同样品的气味信息进行简单的比对分析，通过采集标样信息建立数据库，再利用化学计量学的统计分析方法对未知样品进行定性和定量分析[7]。与常用的分析仪器相比，电子鼻具有客观、准确、快捷地评价气味，并且重复性好的特点[8-9]。样品无须前处理，不用有机溶剂，是一种“绿色”的仿生检测仪器，且便于携带，可进行实时检测。更为突出的是它灵敏度高、测量数据与人类的感官评价相关性好[10]。邓高燕等[11]利用电子鼻技术对两种细菌在菌株水平上挥发性代谢产物进行研究，表明利用电子鼻进行区分和鉴定具有一定的可行性。青勋涛等[12]利用自己开发的气味浓缩电子鼻提高了两株病原菌的区分能力，表明电子鼻技术在微生物快速检测上具有应用潜力。喻勇新等[13]利用电子鼻技术检测普通过夜培养后的三种细菌培养液，Concina等[14]将其应用到加工番茄中的微生物污染检测。
本文利用PEN3型电子鼻对水果常见腐败菌灰葡萄孢霉、根霉、炭疽菌的离体培养代谢挥发物质进行提取；对电子鼻技术对病原菌的快速检测及判别进行了可行性分析；采用电子鼻自带的Winmuster软件进行主成分分析（Principal component analysis，PCA），SPSS软件进行神经网络判别，结合气质联用（Gas chromatography mass spectrometry, GC-MS）技术鉴定出腐败菌的主要特征气体，为电子鼻技术快速检测病原菌提供了理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 培养基
马铃薯葡萄糖琼脂（Potato dextrose agar，PDA）培养基，上海盛思生化科技有限公司。
1.1.2 病原菌
选择草莓采后感染常见的3种病原菌：灰葡萄孢霉、根霉和炭疽菌，来自实验室保藏菌种。
1.2 试验仪器
便携式电子鼻（德国AIRSENSE公司，PEN3），气质联用仪（美国安捷伦公司，7890A/5975C），固相微萃取装置（美国Supelco公司，型号为100 μm PDMS/DVB），电子天平（美国奥豪斯公司，Adventure TM，精度0.01 g）等。
1.3 试验方法
1.3.1菌悬液的制备与接种
将病原菌接种到PDA培养基上，在26 ℃活化培养7–10天之后，用无菌水（含有0.05% *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
Tween-80）冲洗下孢子，通过血球计数法，分别吸取浓度为1×107spores/mL灰葡萄孢霉、根霉、炭疽菌悬浮液100uL在直径为90mm的平板上铺板，对照组用无菌水（CK），28℃下培养。
1.3.2 传感器响应值测定
提取培养第0h、12h、24h、36h、48h的培养基电子鼻响应值，将平板样品放置于1L的烧杯中，并用锡箔纸封口，于28℃下静置30min后进行电子鼻测定。实验参数为：流速400mL/min，测定时间60s，洗气时间110s，样品准备时间5s，自动调零时间5s。每种菌每次测定60个平板。
1.3.3 气质联用法测定挥发性物质
每种处理组取9个平板，每三个平板为一个样品单元，设三个平行。将培养基切碎放入250mL的锥形瓶内密封后放到28℃水浴锅，用老化过的PDMS/DVB萃取头萃取40min。气质联用（GC-MS）测定方法参照Thomas RH等[15]的研究。气相色谱仪进样口温度设为240 ℃，PDMS/DVB萃取头于进样口解析3 min；柱温：50 ℃保持5 min，然后以2 ℃/ min升至200 ℃，保持10 min；FID检测器，240 ℃；离子源温度230 ℃；载气He，流速1 mL/min；扫描范围：质荷比m/z，30-450。各组分经NIST谱库(2008版)检索确定，仅选择匹配度大于80%的组分。
1.3.4 数据处理
采用电子鼻自带的Winmuster软件进行主成分分析（Principal component analysis，PCA），SPSS软件进行神经网络判别，利用Excel进行其他分析。
2.2 不同病原菌处理组和CK组的PDA培养基对照
如图2所示，灰霉组与CK组，以及炭疽组与CK组在0h、24时在肉眼观测下均无明显差异，因而无法进行区分；根霉组与CK组在0h无法通过肉眼区分，而24h时就可以通过肉眼进行有效区分。该结果表明，根霉在PDA培养基上生长旺盛，菌丝明显可辨，因而可通过肉眼进行简易区分；但是灰霉和炭疽菌在PDA培养基上没有出现肉眼可辨的明显菌丝，而通过上述雷达图结果分析可知灰霉和炭疽菌在电子鼻传感器检测下有明显气味响应变化，因此，基于电子鼻对灰霉和炭疽的早期判别的研究具有现实意义。
摘要：为了实现电子鼻对水果中常见腐败菌的早期判别，在PDA培养基上分别接种灰葡萄孢霉、根霉和炭疽菌3种水果主要病原菌，以无菌水处理为对照，利用 PEN3型电子鼻每12h提取病原菌的气味，同时利用气质联用技术（GC-MS）分析其挥发性组分。结果表明，12h后，主成分分析能够区分炭疽组和空白对照组；24h后，处理组和对照组能够完全区分，且病原菌种类也可以较好区分。通过SPSS软件进行神经网络判别，建模组的总体正确率达97.00％，验证组的总体正确率达97.20％。气质联用技术结果表明病原菌早期离体培养阶段挥发性物质的变化主要体现在烃类、醇类及酯类。本研究结果为电子鼻技术检测水果早期病害及区分水果采后感染不同腐败菌提供了理论基础。
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关键字:电子鼻；腐败菌；早期判别；气质联用
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摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 2
1 材料与方法 2
1.1 试验材料 2
1.1.1 培养基 2
1.1.2 病原菌 3
1.2 试验仪器 3
1.3 试验方法 3
1.3.1菌悬液的制备与接种 3
1.3.2 传感器响应值测定 3
1.3.3 气质联用法测定挥发性物质 3
1.3.4 数据处理 3
2 结果及分析 3
2.1 电子鼻检测腐败菌气味的可行性分析 3
2.1.1 CK组的响应值变化 4
2.1.2 灰霉组的响应值变化 5
2.1.3 根霉组的响应值变化 5
2.1.4 炭疽组的响应值变化 5
2.2 不同病原菌处理组和CK组的PDA培养基对照 5
2.3 不同病原菌处理组和CK组的传感器响应值主成分分析 6
2.4 神经网络判别 7
2.5 气相质谱联用法检测结果分析 8
3 结论 9
致谢 10
参考文献: 10
基于电子鼻对水果主要腐败微生物的早期判别
引言
引言
水果是人们日常生活中不可缺少的食品之一，它含有丰富的碳水化合物、有机酸、维生素及无机盐，是人类重要的营养源。也正是由于新鲜水果含有高浓度的糖分和其它营养物质，以及适合微生物生长的理想水活性，同时其较低的pH值特别适合真菌生长，果实易潜入多种真菌而肉眼不易检出[1]。腐败微生物在繁殖过程中产生大量有毒物质 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
，易导致水果食用品质降低，加速腐烂变质过程，缩短了货架期，造成巨大经济损失。因此，微生物控制是水果质量安全控制中的关键问题[2]。
水果采后常见的致腐菌有灰葡萄孢霉（Botrytis cinerea）、根霉（Rhizopus sp.）、炭疽菌（Colletotrichum sp.）等[3]。目前常用的微生物检测方法大致包括分离培养鉴定法、生化鉴定法、酶联免疫吸附法（ELISA）、DNA 杂交和定量 PCR （Quantitative polymerase chain reaction，QPCR）等方法[4-5]。传统的微生物检验方法灵敏度高，费用低，但检测所需时间较长且工作量庞大。现代免疫学和分子生物学特异性好效率高，但一般样品预处理过程比较复杂，且较难达到实时检测的目的[6]。
电子鼻是模仿人和动物的鼻子，用于分析、识别、检测复杂气味和挥发性成分的新型仪器。电子鼻根据对不同样品的气味信息进行简单的比对分析，通过采集标样信息建立数据库，再利用化学计量学的统计分析方法对未知样品进行定性和定量分析[7]。与常用的分析仪器相比，电子鼻具有客观、准确、快捷地评价气味，并且重复性好的特点[8-9]。样品无须前处理，不用有机溶剂，是一种“绿色”的仿生检测仪器，且便于携带，可进行实时检测。更为突出的是它灵敏度高、测量数据与人类的感官评价相关性好[10]。邓高燕等[11]利用电子鼻技术对两种细菌在菌株水平上挥发性代谢产物进行研究，表明利用电子鼻进行区分和鉴定具有一定的可行性。青勋涛等[12]利用自己开发的气味浓缩电子鼻提高了两株病原菌的区分能力，表明电子鼻技术在微生物快速检测上具有应用潜力。喻勇新等[13]利用电子鼻技术检测普通过夜培养后的三种细菌培养液，Concina等[14]将其应用到加工番茄中的微生物污染检测。
本文利用PEN3型电子鼻对水果常见腐败菌灰葡萄孢霉、根霉、炭疽菌的离体培养代谢挥发物质进行提取；对电子鼻技术对病原菌的快速检测及判别进行了可行性分析；采用电子鼻自带的Winmuster软件进行主成分分析（Principal component analysis，PCA），SPSS软件进行神经网络判别，结合气质联用（Gas chromatography mass spectrometry, GC-MS）技术鉴定出腐败菌的主要特征气体，为电子鼻技术快速检测病原菌提供了理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 培养基
马铃薯葡萄糖琼脂（Potato dextrose agar，PDA）培养基，上海盛思生化科技有限公司。
1.1.2 病原菌
选择草莓采后感染常见的3种病原菌：灰葡萄孢霉、根霉和炭疽菌，来自实验室保藏菌种。
1.2 试验仪器
便携式电子鼻（德国AIRSENSE公司，PEN3），气质联用仪（美国安捷伦公司，7890A/5975C），固相微萃取装置（美国Supelco公司，型号为100 μm PDMS/DVB），电子天平（美国奥豪斯公司，Adventure TM，精度0.01 g）等。
1.3 试验方法
1.3.1菌悬液的制备与接种
将病原菌接种到PDA培养基上，在26 ℃活化培养7–10天之后，用无菌水（含有0.05% *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
Tween-80）冲洗下孢子，通过血球计数法，分别吸取浓度为1×107spores/mL灰葡萄孢霉、根霉、炭疽菌悬浮液100uL在直径为90mm的平板上铺板，对照组用无菌水（CK），28℃下培养。
1.3.2 传感器响应值测定
提取培养第0h、12h、24h、36h、48h的培养基电子鼻响应值，将平板样品放置于1L的烧杯中，并用锡箔纸封口，于28℃下静置30min后进行电子鼻测定。实验参数为：流速400mL/min，测定时间60s，洗气时间110s，样品准备时间5s，自动调零时间5s。每种菌每次测定60个平板。
1.3.3 气质联用法测定挥发性物质
每种处理组取9个平板，每三个平板为一个样品单元，设三个平行。将培养基切碎放入250mL的锥形瓶内密封后放到28℃水浴锅，用老化过的PDMS/DVB萃取头萃取40min。气质联用（GC-MS）测定方法参照Thomas RH等[15]的研究。气相色谱仪进样口温度设为240 ℃，PDMS/DVB萃取头于进样口解析3 min；柱温：50 ℃保持5 min，然后以2 ℃/ min升至200 ℃，保持10 min；FID检测器，240 ℃；离子源温度230 ℃；载气He，流速1 mL/min；扫描范围：质荷比m/z，30-450。各组分经NIST谱库(2008版)检索确定，仅选择匹配度大于80%的组分。
1.3.4 数据处理
采用电子鼻自带的Winmuster软件进行主成分分析（Principal component analysis，PCA），SPSS软件进行神经网络判别，利用Excel进行其他分析。
2.2 不同病原菌处理组和CK组的PDA培养基对照
如图2所示，灰霉组与CK组，以及炭疽组与CK组在0h、24时在肉眼观测下均无明显差异，因而无法进行区分；根霉组与CK组在0h无法通过肉眼区分，而24h时就可以通过肉眼进行有效区分。该结果表明，根霉在PDA培养基上生长旺盛，菌丝明显可辨，因而可通过肉眼进行简易区分；但是灰霉和炭疽菌在PDA培养基上没有出现肉眼可辨的明显菌丝，而通过上述雷达图结果分析可知灰霉和炭疽菌在电子鼻传感器检测下有明显气味响应变化，因此，基于电子鼻对灰霉和炭疽的早期判别的研究具有现实意义。
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