乳酸菌生物膜载体的制备和性能研究
细菌生物膜是细菌为适应环境而形成的一种相对于浮游单个微生物的生存形态。生物膜稳定的系统构造对于提高细菌的抗逆性、菌种活性、稳定菌种品质具有显著优势。鉴于乳酸菌是食品工业生产中常用的发酵菌种，本次应用聚乳酸（PLA）材料，添加不同浓度的营养物质调配出不同种类的生物膜载体，对乳酸菌进行培养形成生物膜，并研究其应用于食品发酵中的可能性。结果显示不同成分的生物膜载体对于乳酸菌的抗逆性均有不同程度的提高。添加了2%微晶纤维素（MCC）的生物膜载体可以使冻后生物膜的菌种存活率高达41.94%，在优化菌种品质的同时载体本身的物理性质也较为稳定，因此将生物膜引进乳酸菌发酵工业是具有可行性并具有巨大的发展前景。
目录
摘要 1
关键词 1
1材料与方法 2
1.1材料 2
1.1.1试剂与培养基 2
1.1.2主要仪器设备 2
1.2实验方法 3
1.2.1生物膜载体的制备 3
1.2.2乳酸菌生物膜培养 3
1.2.3生物膜载体物理稳定性测试 4
2结果与分析 4
2.1不同浓度添加物生物膜载体冷冻前平板稀释计数结果 4
2.2不同浓度添加物生物膜载体抗冻性研究 5
2.3不同浓度添加物生物膜载体颜色测定分析 5
2.4不同浓度添加物生物膜载体溶解性测定分析 6
2.5不同浓度添加物生物膜载体热稳定性测试 7
3讨论 8
致谢 10
参考文献 10
乳酸菌生物膜载体的制备和性能研究
引言
细菌处处存在，悬浮于我们周围，但是其实绝大部分的细菌并不是像我们想象中以浮游的状态单个存在，而是以惰性或者活性实体表面作为载体进行附着，然后菌体自身会分泌出粘性胞外聚合物（主要有胞外多糖，蛋白和胞外 DNA），并在这些胞外聚合物及其基质网包裹下进行生长繁殖而形成结构性细菌群落。这种结构性细菌群落便称之为生物膜。生物膜是与浮游细胞相对的，菌株为了适应环境而形成的一种生存形式，是细菌在特殊环境下的特殊状态。过往研究显示生物膜拥有浮游菌体所不具备的几个优势特性：（1）耐药性增强，对抗菌剂的 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
耐受性增加；（2）对环境变化的适应性增强，抗逆性大大提高；（3）不受宿主免疫系统的攻击[1]。因此如若可以将发酵工业常用菌种乳酸菌以生物膜形式进行添加应用必会在促进微生物生长的同时增强菌种的抗逆性与发酵活力，提高和稳定菌种与产品品质，改革技术路线，简化生产流程，提高生产质量与效率。
而生物膜形成的第一步就是找到合适的载体表面进行黏附，因此载体对于生物膜形成的诱导性与调控性至关重要，因此在生物膜载体的制备选材方面必须谨慎。而PPLA作为一种新兴材料，因其可降解性，生物可吸收性，无毒无害性在在食品包装，农用薄膜，骨科材料，药物控释制剂方面得到了广泛的应用，在这一方面的研究开发也是不断地更新进步[2]。朱久进关于聚乳酸固载环糊精的制备及细胞相容性实验[3]，何朝辉对聚乳酸纳米粒子载药系统的构建及其体外药物释放行为研究[5]，李晓关于胶原蛋白改性聚乳酸载药微球的制备及性能研究[6]既证明了聚乳酸作为固定化载体的可能性，也为如何利用聚乳酸制备固相化载体提供了可行性分析，理论指导以及技术支持。鉴于以上几点，我们为什么不将生物膜技术，聚乳酸材料，乳酸发酵工业三者相结合，让乳酸菌发酵生产工艺流程更加科学，菌种更加稳定，品质更进一步呢。本次试验便是要让三者配合，应用聚乳酸（PPLA）材料，添加不同浓度的营养物质调配出不同种类的生物膜载体，对乳酸菌进行培养形成乳酸菌生物膜，研究这种生物膜载体在菌种发酵方面应用的可行性。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1试剂与培养基
PLA：相对分子质量约为115000，国药集团化学试剂有限公司；二氯甲烷：分析纯，天津市富宇精细化工有限公司；
MRS液体培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母膏5g/L，无水乙酸钠5g/L，柠檬酸三铵2g/L，磷酸氢二钾2.62g/L，硫酸镁0.58g/L，硫酸锰0.198g/L，吐温1ml/L，明胶1%；
MRS固体培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母膏5g/L，无水乙酸钠5g/L，柠檬酸三铵2g/L，磷酸氢二钾2.62g/L，硫酸镁0.58g/L，硫酸锰0.198g/L，吐温1ml/L，琼脂1.5%；
生物膜营养液：（葡萄糖40g/L，蛋白胨20g/L，牛肉膏20g/L，酵母膏10g/L，无水乙酸钠10g/L，柠檬酸三铵4g/L，磷酸氢二钾5.24g/L，硫酸镁1.16g/L，硫酸锰0.3968g/L，吐温1ml/L，明胶1%）加热煮沸直至全部物质溶解，冷却后待用；
生物膜有机相制备： 每100ml二氯甲烷中加入5gPLLA，配成浓度为（5gPLA/100ml二氯甲烷）聚合物溶液，置于磨口玻璃瓶中，在通风橱中放置72h待其充分溶解后使用。
活化瓶：60gMRS液体培养基注入螺口三角塑料瓶进行121℃湿热灭菌15min后冷却至室温后待用；
碾碎袋：取小型塑料袋数个，每个塑料袋加入大量小型玻璃珠，将制作好的碾碎袋放入烧杯中121℃湿热灭菌15min后冷却至室温后待用；
1.1.2主要仪器设备
表1 主要仪器
仪器名称
生产厂家
LRH系列生化培养箱
上海一恒科学仪器有限公司
LDZX50KBS立式压力蒸汽灭菌锅
上海中安医疗器械厂
MP2002电子天平
上海舜宇恒平科学仪器有限公司
XP105DR?分析天平
瑞士METTLER?TOLEDO公司
KH5200DB型数控超声波清洗器
昆山禾创超声仪器有限公司
锥形瓶、各式枪头等
南京寿德试验器材有限公司
781型磁力加热搅拌器
上海南汇电讯器材厂
SWCJ1FD洁净工作台
目录
摘要 1
关键词 1
1材料与方法 2
1.1材料 2
1.1.1试剂与培养基 2
1.1.2主要仪器设备 2
1.2实验方法 3
1.2.1生物膜载体的制备 3
1.2.2乳酸菌生物膜培养 3
1.2.3生物膜载体物理稳定性测试 4
2结果与分析 4
2.1不同浓度添加物生物膜载体冷冻前平板稀释计数结果 4
2.2不同浓度添加物生物膜载体抗冻性研究 5
2.3不同浓度添加物生物膜载体颜色测定分析 5
2.4不同浓度添加物生物膜载体溶解性测定分析 6
2.5不同浓度添加物生物膜载体热稳定性测试 7
3讨论 8
致谢 10
参考文献 10
乳酸菌生物膜载体的制备和性能研究
引言
细菌处处存在，悬浮于我们周围，但是其实绝大部分的细菌并不是像我们想象中以浮游的状态单个存在，而是以惰性或者活性实体表面作为载体进行附着，然后菌体自身会分泌出粘性胞外聚合物（主要有胞外多糖，蛋白和胞外 DNA），并在这些胞外聚合物及其基质网包裹下进行生长繁殖而形成结构性细菌群落。这种结构性细菌群落便称之为生物膜。生物膜是与浮游细胞相对的，菌株为了适应环境而形成的一种生存形式，是细菌在特殊环境下的特殊状态。过往研究显示生物膜拥有浮游菌体所不具备的几个优势特性：（1）耐药性增强，对抗菌剂的 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
耐受性增加；（2）对环境变化的适应性增强，抗逆性大大提高；（3）不受宿主免疫系统的攻击[1]。因此如若可以将发酵工业常用菌种乳酸菌以生物膜形式进行添加应用必会在促进微生物生长的同时增强菌种的抗逆性与发酵活力，提高和稳定菌种与产品品质，改革技术路线，简化生产流程，提高生产质量与效率。
而生物膜形成的第一步就是找到合适的载体表面进行黏附，因此载体对于生物膜形成的诱导性与调控性至关重要，因此在生物膜载体的制备选材方面必须谨慎。而PPLA作为一种新兴材料，因其可降解性，生物可吸收性，无毒无害性在在食品包装，农用薄膜，骨科材料，药物控释制剂方面得到了广泛的应用，在这一方面的研究开发也是不断地更新进步[2]。朱久进关于聚乳酸固载环糊精的制备及细胞相容性实验[3]，何朝辉对聚乳酸纳米粒子载药系统的构建及其体外药物释放行为研究[5]，李晓关于胶原蛋白改性聚乳酸载药微球的制备及性能研究[6]既证明了聚乳酸作为固定化载体的可能性，也为如何利用聚乳酸制备固相化载体提供了可行性分析，理论指导以及技术支持。鉴于以上几点，我们为什么不将生物膜技术，聚乳酸材料，乳酸发酵工业三者相结合，让乳酸菌发酵生产工艺流程更加科学，菌种更加稳定，品质更进一步呢。本次试验便是要让三者配合，应用聚乳酸（PPLA）材料，添加不同浓度的营养物质调配出不同种类的生物膜载体，对乳酸菌进行培养形成乳酸菌生物膜，研究这种生物膜载体在菌种发酵方面应用的可行性。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1试剂与培养基
PLA：相对分子质量约为115000，国药集团化学试剂有限公司；二氯甲烷：分析纯，天津市富宇精细化工有限公司；
MRS液体培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母膏5g/L，无水乙酸钠5g/L，柠檬酸三铵2g/L，磷酸氢二钾2.62g/L，硫酸镁0.58g/L，硫酸锰0.198g/L，吐温1ml/L，明胶1%；
MRS固体培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母膏5g/L，无水乙酸钠5g/L，柠檬酸三铵2g/L，磷酸氢二钾2.62g/L，硫酸镁0.58g/L，硫酸锰0.198g/L，吐温1ml/L，琼脂1.5%；
生物膜营养液：（葡萄糖40g/L，蛋白胨20g/L，牛肉膏20g/L，酵母膏10g/L，无水乙酸钠10g/L，柠檬酸三铵4g/L，磷酸氢二钾5.24g/L，硫酸镁1.16g/L，硫酸锰0.3968g/L，吐温1ml/L，明胶1%）加热煮沸直至全部物质溶解，冷却后待用；
生物膜有机相制备： 每100ml二氯甲烷中加入5gPLLA，配成浓度为（5gPLA/100ml二氯甲烷）聚合物溶液，置于磨口玻璃瓶中，在通风橱中放置72h待其充分溶解后使用。
活化瓶：60gMRS液体培养基注入螺口三角塑料瓶进行121℃湿热灭菌15min后冷却至室温后待用；
碾碎袋：取小型塑料袋数个，每个塑料袋加入大量小型玻璃珠，将制作好的碾碎袋放入烧杯中121℃湿热灭菌15min后冷却至室温后待用；
1.1.2主要仪器设备
表1 主要仪器
仪器名称
生产厂家
LRH系列生化培养箱
上海一恒科学仪器有限公司
LDZX50KBS立式压力蒸汽灭菌锅
上海中安医疗器械厂
MP2002电子天平
上海舜宇恒平科学仪器有限公司
XP105DR?分析天平
瑞士METTLER?TOLEDO公司
KH5200DB型数控超声波清洗器
昆山禾创超声仪器有限公司
锥形瓶、各式枪头等
南京寿德试验器材有限公司
781型磁力加热搅拌器
上海南汇电讯器材厂
SWCJ1FD洁净工作台
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