紫菜多肽的制备及其活性研究
目 录
1 引言 1
1.1 国内外研究现状 1
1.2 生物活性肽概述 2
1.3 生物活性肽的种类与功能 2
1.4 提取工艺 3
1.5 本课题研究的内容 3
2 实验材料 3
2.1 主要原料、设备和试剂 3
2.2 主要设备 4
2.3 主要试剂 4
3 实验方法 5
3.1 紫菜中蛋白质的提取工艺流程 5
3.2 工艺要点 5
3.3 紫菜蛋白多肽活性的测定 8
4 实验结果分析 9
4.1 紫菜中蛋白质含量的测定 9
4.2 紫菜中蛋白质酶解工艺的研究 9
4.3 多肽制备结果分析 19
4.4 紫菜多肽的活性研究 21
结 论 25
致 谢 26
参考文献 27
1 引言
紫菜是海中可供食用的藻类，是海中互生藻类的统称，其蛋白质含量十分丰富，高达25%[1]，同时，还含有大量有益于人体健康的维生素、矿物质、微量元素以及血脂、降低胆固醇、活化血管和降血压的生物活性物质和药用成分[2]，是一种健康食品。
我国是世界上最大的紫菜生产国，大多数只用来直接食用，或制作成干制品食用，目前，还没有进行其他方面的开发和利用。然而，对于藻类的一些高科技产品依赖于昂贵的进口，例如一些药品和试剂。
因此，选用紫菜提取蛋白多肽，具有成本低，得率高的优点，具有较好的利用价值。利用廉价的植物蛋白开发出具有高附加值的多肽产品，充分利用植物蛋白的资源，将其应用于人类食品营养品中产生可观的经 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
济效益和社会效益。本课题在探索从紫菜中提取藻胆蛋白多肽的最佳条件，并对其活性进行研究，为其在功能食品、化妆品和药品等方面的应用提供依据。目前，科学家们研究的热点放在从各种生物中开发具有活性功能的多肽，其中应用最多的是蛋白酶酶解产物来制备。本实验选用紫菜为研究对象，通过酶解蛋白提取多肽，并从各个方面分析考虑提取的最佳因素，进而进行下一步的深入研究。
1.1 国内外研究现状
据报道，国外越来越注重研究多肽的开发与应用，其中酪蛋白肽、血蛋白肽、大豆肽、小麦肽、玉米肽、水产蛋白肽等多肽占主要地位。20世纪70年代，美国就成立了专门研究多肽的机构，取得了比较好的成果。20世纪80年代，日本致力于研制动植物蛋白多肽食品，其中大豆多肽的效果最好。此外，在欧洲的一些国家，有专门从事多肽研制和开发部门。现在，主要的多肽类制品主要包括两大类：一类是具有活性功能的保健食品，如多肽婴幼儿食品、促钙吸收食品、多肽老人食品、抑制血压升高的食品、多肽饮料、多肽运动食品及患者营养补充剂等；另一类是富含多肽的药品和试剂[4-6]。
20世纪80年代中后期，我国也开始在大豆多肽上进行研究开发，效果比较好的包括大量有关大豆蛋白肽的酶法生产、功能性质和生理活性的研究。总的来说，我国越来越注重于多肽食品和多肽保健品的研制与利用。但是，就目前状况来说，我国与其他国家在先进技术上还存在很大的差距，还需要对多肽的进行深入研究。
藻胆蛋白主要包括别藻蓝蛋白、藻红蛋白和藻蓝蛋白[7]。藻胆蛋白在藻类中的含量较大，约占细胞干重的25%～28%[8]，藻胆蛋白不仅可以作为荧光探针，用于医学诊断、细胞学和免疫学的研究，而且因其具有抗氧化、抗肿瘤和提高机体免疫力等重要药理功能，在功能食品、药品和化妆品等领域中，都具有广泛的应用前景[9-12]。据报道，我国已经有用紫球藻、红毛菜和螺旋藻作为原料，来提取藻胆蛋白的研究，但由于这种做法成本高、而得率低，无法进行产业化生产。
1.2 生物活性肽概述
生物活性肽(BAP)就是有益于生物机体的生命活动或是具有生理作用的肽类化合物，相对分子质量比较小，且具有多种生物学功能的多肽[13]。是介于氨基酸与蛋白质之间的分子聚合物，因此分子结构复杂程度不同，是大的由数十个氨基酸通过肽键连接而成，小的只有两个氨基酸组成，这些多肽可以被酰基化、磷酸化或糖基化[14]。由于大部分活性肽是以非活性状态存在的，当其在合适条件下遇到蛋白酶可以被水解，这时候其活性会被释放出来[15]。
1.3 生物活性肽的种类与功能
1.3.1 抗氧化肽
具有抑制生物大分子过氧化或清除体内自由基功能的多肽称为抗氧化肽。通常情况下，抗氧化肽可分为天然抗氧化肽、人工合成抗氧化肽和蛋白降解产生的抗氧化肽。一般来说，生物体内本身存在的抗氧化性肽称为天然抗氧化肽，主要包括肌肽和谷胱甘肽。化学合成和酶法合成可以合成人工抗氧化肽，通过合成酶的催化，同时用氨基酸和小肽作为底物来合成抗氧化肽的方法是酶法合成[16]。
1.3.2 抗肿瘤肽
抗肿瘤肽主要包括生物体自身含有的活性肽和人工合成的。这种多肽含有多种功能其中主要包括具有抑制肿瘤新生血管生成、阻滞肿瘤细胞周期及诱导细胞凋亡、调控蛋白降解、增强免疫作用、干扰肿瘤细胞DNA 合成等功能[16]。对生物体本身来说自身含有的活 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
性肽比较少，当下人工合成和依靠其他方法提取多肽已成为研究的重点。
1.3.3 抗菌肽
抗菌肽顾名思义是指具有抗菌作用的多肽，它是一类小分子蛋白质，是抵抗外来病原入侵产生的，构成很多种生物先天性非特异性防御系统的重要组成部分[16]。
1.3.4 免疫活性肽
免疫活性肽可以分为天然、化学合成和重组免疫活性肽三类，这三类活性肽都具有增强机体免疫力和进行免疫调节作用[16]，其中天然的也比较少，大部分依靠化学合成和重组技术。
1.4 提取工艺
当前，国内外采用分离提取法、基因重组法、化学合成法、蛋白酶水解法等方法来制备多肽[17]。藻胆蛋白是一种胞内蛋白，整个藻胆蛋白提取纯化的一个关键步骤就是，选择合适的条件破碎藻体细胞，并且最大限度地回收天然状态的藻胆蛋白，得到其粗提液。藻胆蛋白的得率越高表明细胞破碎的程度越高[18]，但是过于强烈的细胞破碎方法也会产生副作用，比如大量析出多糖等杂质，影响分离纯化的进一步进行[19]。据报道，目前提取紫菜蛋白主要采用溶胀法、反复冻融法和脉冲超声法等破壁方法[20]；紫菜多糖的提取主要依靠冷水提取法、热水提取法，以及微波和超声波等辅助方法，但提取率比较低[20]。另一方面，根据研究报道发现，利用发酵法，海藻可溶性物质的提取率可以得到提高[20]；枯草芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌都能分泌纤维素酶和蛋白酶等多种酶[25]，一定程度上会破坏紫菜的细胞壁[20]。
上述每一种细胞破碎方法都存在一定的局限性，通常在实际操作时，可以将几种方法混合使用，从而尽可能地破碎藻体细胞，让藻胆蛋白充分溶解出来[21，23]。
1.5 本课题研究的内容
（1）采用水提、PB缓冲液透析、硫酸铵盐析法提取紫菜蛋白粗液；
（2）研究并选择出最适蛋白酶酶解紫菜粗蛋白液，确定出最适酶解条件；
（3）采用离子交换层析、凝胶过滤层析分离纯化紫菜多肽，并对其抗氧化活性、乳化性和乳化稳定性，起泡性和起泡稳定性进行研究测定。
1 引言 1
1.1 国内外研究现状 1
1.2 生物活性肽概述 2
1.3 生物活性肽的种类与功能 2
1.4 提取工艺 3
1.5 本课题研究的内容 3
2 实验材料 3
2.1 主要原料、设备和试剂 3
2.2 主要设备 4
2.3 主要试剂 4
3 实验方法 5
3.1 紫菜中蛋白质的提取工艺流程 5
3.2 工艺要点 5
3.3 紫菜蛋白多肽活性的测定 8
4 实验结果分析 9
4.1 紫菜中蛋白质含量的测定 9
4.2 紫菜中蛋白质酶解工艺的研究 9
4.3 多肽制备结果分析 19
4.4 紫菜多肽的活性研究 21
结 论 25
致 谢 26
参考文献 27
1 引言
紫菜是海中可供食用的藻类，是海中互生藻类的统称，其蛋白质含量十分丰富，高达25%[1]，同时，还含有大量有益于人体健康的维生素、矿物质、微量元素以及血脂、降低胆固醇、活化血管和降血压的生物活性物质和药用成分[2]，是一种健康食品。
我国是世界上最大的紫菜生产国，大多数只用来直接食用，或制作成干制品食用，目前，还没有进行其他方面的开发和利用。然而，对于藻类的一些高科技产品依赖于昂贵的进口，例如一些药品和试剂。
因此，选用紫菜提取蛋白多肽，具有成本低，得率高的优点，具有较好的利用价值。利用廉价的植物蛋白开发出具有高附加值的多肽产品，充分利用植物蛋白的资源，将其应用于人类食品营养品中产生可观的经 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
济效益和社会效益。本课题在探索从紫菜中提取藻胆蛋白多肽的最佳条件，并对其活性进行研究，为其在功能食品、化妆品和药品等方面的应用提供依据。目前，科学家们研究的热点放在从各种生物中开发具有活性功能的多肽，其中应用最多的是蛋白酶酶解产物来制备。本实验选用紫菜为研究对象，通过酶解蛋白提取多肽，并从各个方面分析考虑提取的最佳因素，进而进行下一步的深入研究。
1.1 国内外研究现状
据报道，国外越来越注重研究多肽的开发与应用，其中酪蛋白肽、血蛋白肽、大豆肽、小麦肽、玉米肽、水产蛋白肽等多肽占主要地位。20世纪70年代，美国就成立了专门研究多肽的机构，取得了比较好的成果。20世纪80年代，日本致力于研制动植物蛋白多肽食品，其中大豆多肽的效果最好。此外，在欧洲的一些国家，有专门从事多肽研制和开发部门。现在，主要的多肽类制品主要包括两大类：一类是具有活性功能的保健食品，如多肽婴幼儿食品、促钙吸收食品、多肽老人食品、抑制血压升高的食品、多肽饮料、多肽运动食品及患者营养补充剂等；另一类是富含多肽的药品和试剂[4-6]。
20世纪80年代中后期，我国也开始在大豆多肽上进行研究开发，效果比较好的包括大量有关大豆蛋白肽的酶法生产、功能性质和生理活性的研究。总的来说，我国越来越注重于多肽食品和多肽保健品的研制与利用。但是，就目前状况来说，我国与其他国家在先进技术上还存在很大的差距，还需要对多肽的进行深入研究。
藻胆蛋白主要包括别藻蓝蛋白、藻红蛋白和藻蓝蛋白[7]。藻胆蛋白在藻类中的含量较大，约占细胞干重的25%～28%[8]，藻胆蛋白不仅可以作为荧光探针，用于医学诊断、细胞学和免疫学的研究，而且因其具有抗氧化、抗肿瘤和提高机体免疫力等重要药理功能，在功能食品、药品和化妆品等领域中，都具有广泛的应用前景[9-12]。据报道，我国已经有用紫球藻、红毛菜和螺旋藻作为原料，来提取藻胆蛋白的研究，但由于这种做法成本高、而得率低，无法进行产业化生产。
1.2 生物活性肽概述
生物活性肽(BAP)就是有益于生物机体的生命活动或是具有生理作用的肽类化合物，相对分子质量比较小，且具有多种生物学功能的多肽[13]。是介于氨基酸与蛋白质之间的分子聚合物，因此分子结构复杂程度不同，是大的由数十个氨基酸通过肽键连接而成，小的只有两个氨基酸组成，这些多肽可以被酰基化、磷酸化或糖基化[14]。由于大部分活性肽是以非活性状态存在的，当其在合适条件下遇到蛋白酶可以被水解，这时候其活性会被释放出来[15]。
1.3 生物活性肽的种类与功能
1.3.1 抗氧化肽
具有抑制生物大分子过氧化或清除体内自由基功能的多肽称为抗氧化肽。通常情况下，抗氧化肽可分为天然抗氧化肽、人工合成抗氧化肽和蛋白降解产生的抗氧化肽。一般来说，生物体内本身存在的抗氧化性肽称为天然抗氧化肽，主要包括肌肽和谷胱甘肽。化学合成和酶法合成可以合成人工抗氧化肽，通过合成酶的催化，同时用氨基酸和小肽作为底物来合成抗氧化肽的方法是酶法合成[16]。
1.3.2 抗肿瘤肽
抗肿瘤肽主要包括生物体自身含有的活性肽和人工合成的。这种多肽含有多种功能其中主要包括具有抑制肿瘤新生血管生成、阻滞肿瘤细胞周期及诱导细胞凋亡、调控蛋白降解、增强免疫作用、干扰肿瘤细胞DNA 合成等功能[16]。对生物体本身来说自身含有的活 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
性肽比较少，当下人工合成和依靠其他方法提取多肽已成为研究的重点。
1.3.3 抗菌肽
抗菌肽顾名思义是指具有抗菌作用的多肽，它是一类小分子蛋白质，是抵抗外来病原入侵产生的，构成很多种生物先天性非特异性防御系统的重要组成部分[16]。
1.3.4 免疫活性肽
免疫活性肽可以分为天然、化学合成和重组免疫活性肽三类，这三类活性肽都具有增强机体免疫力和进行免疫调节作用[16]，其中天然的也比较少，大部分依靠化学合成和重组技术。
1.4 提取工艺
当前，国内外采用分离提取法、基因重组法、化学合成法、蛋白酶水解法等方法来制备多肽[17]。藻胆蛋白是一种胞内蛋白，整个藻胆蛋白提取纯化的一个关键步骤就是，选择合适的条件破碎藻体细胞，并且最大限度地回收天然状态的藻胆蛋白，得到其粗提液。藻胆蛋白的得率越高表明细胞破碎的程度越高[18]，但是过于强烈的细胞破碎方法也会产生副作用，比如大量析出多糖等杂质，影响分离纯化的进一步进行[19]。据报道，目前提取紫菜蛋白主要采用溶胀法、反复冻融法和脉冲超声法等破壁方法[20]；紫菜多糖的提取主要依靠冷水提取法、热水提取法，以及微波和超声波等辅助方法，但提取率比较低[20]。另一方面，根据研究报道发现，利用发酵法，海藻可溶性物质的提取率可以得到提高[20]；枯草芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌都能分泌纤维素酶和蛋白酶等多种酶[25]，一定程度上会破坏紫菜的细胞壁[20]。
上述每一种细胞破碎方法都存在一定的局限性，通常在实际操作时，可以将几种方法混合使用，从而尽可能地破碎藻体细胞，让藻胆蛋白充分溶解出来[21，23]。
1.5 本课题研究的内容
（1）采用水提、PB缓冲液透析、硫酸铵盐析法提取紫菜蛋白粗液；
（2）研究并选择出最适蛋白酶酶解紫菜粗蛋白液，确定出最适酶解条件；
（3）采用离子交换层析、凝胶过滤层析分离纯化紫菜多肽，并对其抗氧化活性、乳化性和乳化稳定性，起泡性和起泡稳定性进行研究测定。
版权保护: 本文由 hbsrm.com编辑，转载请保留链接: www.hbsrm.com/swgc/spkxygc/461.html
