江瑶柱粗多糖提取工艺条件的优化
目 录
1 引言 1
1.1 江瑶柱简介 1
1.2 多糖简介 1
1.3 研究目的意义及主要内容 5
2 材料与方法 5
2.1 材料与仪器 5
2.2 实验方法 6
3 结果与讨论 8
3.1 单因素实验 8
3.2 响应面优化实验 11
结 论 19
致 谢 20
参考文献 21
1 引言
伴随着人类对海洋资源的开发利用以及对多糖研究进展的深入，国内外学者对海洋动物多糖的研究日益重视。中国海域生物物种极为丰富，已鉴定的达到20278种，贝类养殖规模也日渐壮大，尤其是扇贝、牡蛎、贻贝和鲍等经济型贝类的养殖规模越来越大。作为人口大国，我国自然资源、工业原料短缺，耕地不足，使得我国面临严峻的粮食短缺问题，而对海洋贝类资源的高效利用和深度开发在很大程度上有利于弥补陆上资源的不足，同时也促进了贝类养殖业的可持续发展。贝类多糖具有抗肿瘤、抗病毒、肝损伤保护、免疫调节等多个生物活性，在功能性保健食品和药物研究方面具有良好的前景。
1.1 江瑶柱简介
栉江瑶俗称“海锨”，属软体动物门、双壳纲、莺蛤目、江珧蛤科、曲江珧蛤属，是一种大型贝类[1]。栉江瑶贝壳略呈三角形或扇形，壳质稍薄而脆，壳顶细尖，位于壳的最前端，后端宽大[2]。生活于低潮线附近至水深30-40 m的泥沙质海底，为营半底埋生活的软体动物。栉江瑶分布广泛，我国主要分布在东南沿海，山东、广东、福建等地，其资源丰富，目前已成为各地开发的主要贝类之一。其贝壳肌特别肥大，可制作珍贵海产品——江瑶柱[1]。肉质鲜美，碳水化合物、蛋白质、氨基酸、不饱和脂肪酸和微量元素的 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
含量较丰富，有较高的营养价值，并且含有各种风味物质，可谓色香味俱全。《本草纲目》中记载道：江瑶气味甘辛平，可以消渴下气，利五脏，止小便。江瑶柱可用作中药药剂，味甘、咸，性平，具有滋阴补肾、调和消食的功效，因此，江瑶柱是很好的滋补产品。
进入二十一世纪后，人们越来越追求食物的营养与饮食健康，扇贝由于其高蛋白、低脂肪、营养丰富的特点，受到了消费者们的热烈追捧。我国贝类养殖规模也不断扩大，但是扇贝类的附加价值开发一直未受到足够的重视，经济效益较低，唯有对其进行深度开发，才能实现高效益的可持续发展。虽然目前有大量有关海洋生物多糖及其活性研究的报道，但是有关江瑶柱多糖的研究仍是空白，本课题以江瑶柱为实验材料研究粗多糖提取条件的优化，为进一步研究江瑶柱多糖的结构和功能提供基础。
1.2 多糖简介
多糖也称聚糖（polysaccharides），是存在于自然界的醛糖或酮糖通过糖苷键连接在一起的聚合物[3]。在自然界中广泛分布，是分子量为数万甚至达数百万的天然大分子物质之一，对维持生命活动起着至关重要的作用，和蛋白质、核酸、脂类构成了最基本的4类生命物质[4]。多糖具有增强免疫力[5]、抗肿瘤[6]、抗病毒[7]、抗凝血[8]等生理调节功能。多糖的提取方式有酸提取、碱提取、酶提取、水提取、微波提取、超声波提取等。经有机溶剂沉淀获得的多糖还含有无机盐、有机溶剂不溶的低分子有机物、色素、大分子蛋白等杂质，所以沉淀所得物只能称为粗多糖[9]。本实验采用热水提取法对江瑶柱进行相关研究，其优势在于提取溶剂经济实惠、安全可靠、环境友好，最重要的是热水提取对多糖的结构和生物活性的影响比较少。
1.2.1 多糖的生物活性
1.2.1.1 免疫调节作用
免疫是指生物机体识别和排除抗原物质的一种保护性反应，破坏和排斥进入人体的抗原物质或人体自身产生的损伤细胞和肿瘤细胞等，以此来维持人体的健康。凡诱发免疫反应的物质皆可称为抗原。机体的免疫能力可大致分为特异性免疫和非特异性免疫。非特异性免疫是生物在发展过程中不断与病原微生物斗争形成的可遗传给后代的一种免疫功能。多糖具有增强非特异性免疫功能的效果，从而达到增强机体免疫功能的作用。多糖可以激活巨噬细胞或增加其吞噬能力来提高免疫能力，如蚕蛹多糖[10]、猪苓多糖[11]等。多糖还可以通过刺激B细胞分泌免疫球蛋白，从而增强机体的体液免疫[12]。
1.2.1.2 抗肿瘤作用
在抗肿瘤方面，多糖通过对肿瘤细胞呈细胞毒作用，从而改变肿瘤细胞膜的生化特性，抑制肿瘤细胞DNA的合成等机制，达到抗肿瘤的目的，从而杀死肿瘤细胞[13]。甲壳胺可以抑制人结肠癌细胞增殖扩散，并且可以将凋亡基因激活从而达到抑制原癌基因的效果[14]。乌贼多糖对HepG2、SKOV3肿瘤细胞有抑制作用，能阻碍他们的生长和转移[15]。
1.2.1.3 抗病毒作用
大量研究发现大部分多糖具有一定的抗病毒作用，尤其是从海洋生物中提取的多糖，由于其高度硫酸化的特点，这类多糖一般对病毒有抑制作用。其作用机制是直接杀死病毒细胞或吸附在宿主细胞上，干扰病毒，抑制其进入宿主细胞内，从而达到间接杀死病毒的效果。Okutani等[16]通过实验研究发现将一种海洋细菌多糖置于低硫酸化的环境下，此多糖能抑制人类免疫缺陷病毒，阻碍其侵 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
染免疫细胞MT4。
1.2.1.4 抗氧化作用
氧化还原反应是机体新陈代谢的重要组成部分，但过多的活性自由基或自由基消除缓慢，自由基产生的脂质过氧化物就会损害细胞、器官，机体加速衰老并且诱发一系列疾病。周文丽等[17]通过对贻贝多糖的研究发现，贻贝多糖能够大幅地提高血清中的SOD水平，达到降低MAD水平的效果，起到抗氧化功效。
1.2.1.5 其他活性
除此以外，多糖还具有降血糖、降血脂、抗炎、抗衰老抗辐射等作用，近年来，随着对多糖的深入研究，根据贝类多糖的保湿性特点，还将其运用到化妆品行业，在一定程度上拓展了贝类多糖的研究方向，给人们研究多糖提供了新的思路。
1.2.2 国内外研究现状
在60年代，多糖被普遍认为在生命有机体内的作用大大不如蛋白质和核酸，一直处于被忽视的地位。近几十年来，随着研究人员对分子生物学及糖化学的深入研究，人们对多糖有了一定程度上的认识。多糖凭借其与免疫调节系统、细胞间的识别、癌症诊疗的紧密关系引起了医药界和分子生物界的强烈关注。如在抗癌方面，Kodama等[18]通过实验研究发现了从Grifola frondosa中提取得到的多糖有抑制肿瘤细胞的功效。在医药方面，卢传亮等[19]通过对马氏珠母贝多糖的分离纯化及保湿性研究，证实了该种多糖具有高于常规保湿剂的保湿功效。
多糖的活性与其结构有着密切关系。多糖的结构极其复杂，而且不同来源的多糖其结构和组成成分也有所不同，目前对多糖结构的研究主要集中在对其一级结构的研究，二级结构和空间结构方面较少[20]。于广利[21]等证实灰树花菌丝体碱溶性多糖有葡萄糖、甘露糖和木糖组成，其主链由6个α-1,3-D-Glc和2个α-1,3-D-Man构成，且主链α-1,3-D-Glc残基0-4位有两个分支，其中一个分支连接3个β-1,4-D-Glc，另一分支连接一个α-1,4-D-Xyl，一个支链由β-1,4-葡聚糖组成，另一个支链由α-1,4-木糖组成。
在研究多糖活性和结构的基础上，人们还发现对多糖进行特定的结构修饰能产或提高多糖的某些生物活性。
1 引言 1
1.1 江瑶柱简介 1
1.2 多糖简介 1
1.3 研究目的意义及主要内容 5
2 材料与方法 5
2.1 材料与仪器 5
2.2 实验方法 6
3 结果与讨论 8
3.1 单因素实验 8
3.2 响应面优化实验 11
结 论 19
致 谢 20
参考文献 21
1 引言
伴随着人类对海洋资源的开发利用以及对多糖研究进展的深入，国内外学者对海洋动物多糖的研究日益重视。中国海域生物物种极为丰富，已鉴定的达到20278种，贝类养殖规模也日渐壮大，尤其是扇贝、牡蛎、贻贝和鲍等经济型贝类的养殖规模越来越大。作为人口大国，我国自然资源、工业原料短缺，耕地不足，使得我国面临严峻的粮食短缺问题，而对海洋贝类资源的高效利用和深度开发在很大程度上有利于弥补陆上资源的不足，同时也促进了贝类养殖业的可持续发展。贝类多糖具有抗肿瘤、抗病毒、肝损伤保护、免疫调节等多个生物活性，在功能性保健食品和药物研究方面具有良好的前景。
1.1 江瑶柱简介
栉江瑶俗称“海锨”，属软体动物门、双壳纲、莺蛤目、江珧蛤科、曲江珧蛤属，是一种大型贝类[1]。栉江瑶贝壳略呈三角形或扇形，壳质稍薄而脆，壳顶细尖，位于壳的最前端，后端宽大[2]。生活于低潮线附近至水深30-40 m的泥沙质海底，为营半底埋生活的软体动物。栉江瑶分布广泛，我国主要分布在东南沿海，山东、广东、福建等地，其资源丰富，目前已成为各地开发的主要贝类之一。其贝壳肌特别肥大，可制作珍贵海产品——江瑶柱[1]。肉质鲜美，碳水化合物、蛋白质、氨基酸、不饱和脂肪酸和微量元素的 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
含量较丰富，有较高的营养价值，并且含有各种风味物质，可谓色香味俱全。《本草纲目》中记载道：江瑶气味甘辛平，可以消渴下气，利五脏，止小便。江瑶柱可用作中药药剂，味甘、咸，性平，具有滋阴补肾、调和消食的功效，因此，江瑶柱是很好的滋补产品。
进入二十一世纪后，人们越来越追求食物的营养与饮食健康，扇贝由于其高蛋白、低脂肪、营养丰富的特点，受到了消费者们的热烈追捧。我国贝类养殖规模也不断扩大，但是扇贝类的附加价值开发一直未受到足够的重视，经济效益较低，唯有对其进行深度开发，才能实现高效益的可持续发展。虽然目前有大量有关海洋生物多糖及其活性研究的报道，但是有关江瑶柱多糖的研究仍是空白，本课题以江瑶柱为实验材料研究粗多糖提取条件的优化，为进一步研究江瑶柱多糖的结构和功能提供基础。
1.2 多糖简介
多糖也称聚糖（polysaccharides），是存在于自然界的醛糖或酮糖通过糖苷键连接在一起的聚合物[3]。在自然界中广泛分布，是分子量为数万甚至达数百万的天然大分子物质之一，对维持生命活动起着至关重要的作用，和蛋白质、核酸、脂类构成了最基本的4类生命物质[4]。多糖具有增强免疫力[5]、抗肿瘤[6]、抗病毒[7]、抗凝血[8]等生理调节功能。多糖的提取方式有酸提取、碱提取、酶提取、水提取、微波提取、超声波提取等。经有机溶剂沉淀获得的多糖还含有无机盐、有机溶剂不溶的低分子有机物、色素、大分子蛋白等杂质，所以沉淀所得物只能称为粗多糖[9]。本实验采用热水提取法对江瑶柱进行相关研究，其优势在于提取溶剂经济实惠、安全可靠、环境友好，最重要的是热水提取对多糖的结构和生物活性的影响比较少。
1.2.1 多糖的生物活性
1.2.1.1 免疫调节作用
免疫是指生物机体识别和排除抗原物质的一种保护性反应，破坏和排斥进入人体的抗原物质或人体自身产生的损伤细胞和肿瘤细胞等，以此来维持人体的健康。凡诱发免疫反应的物质皆可称为抗原。机体的免疫能力可大致分为特异性免疫和非特异性免疫。非特异性免疫是生物在发展过程中不断与病原微生物斗争形成的可遗传给后代的一种免疫功能。多糖具有增强非特异性免疫功能的效果，从而达到增强机体免疫功能的作用。多糖可以激活巨噬细胞或增加其吞噬能力来提高免疫能力，如蚕蛹多糖[10]、猪苓多糖[11]等。多糖还可以通过刺激B细胞分泌免疫球蛋白，从而增强机体的体液免疫[12]。
1.2.1.2 抗肿瘤作用
在抗肿瘤方面，多糖通过对肿瘤细胞呈细胞毒作用，从而改变肿瘤细胞膜的生化特性，抑制肿瘤细胞DNA的合成等机制，达到抗肿瘤的目的，从而杀死肿瘤细胞[13]。甲壳胺可以抑制人结肠癌细胞增殖扩散，并且可以将凋亡基因激活从而达到抑制原癌基因的效果[14]。乌贼多糖对HepG2、SKOV3肿瘤细胞有抑制作用，能阻碍他们的生长和转移[15]。
1.2.1.3 抗病毒作用
大量研究发现大部分多糖具有一定的抗病毒作用，尤其是从海洋生物中提取的多糖，由于其高度硫酸化的特点，这类多糖一般对病毒有抑制作用。其作用机制是直接杀死病毒细胞或吸附在宿主细胞上，干扰病毒，抑制其进入宿主细胞内，从而达到间接杀死病毒的效果。Okutani等[16]通过实验研究发现将一种海洋细菌多糖置于低硫酸化的环境下，此多糖能抑制人类免疫缺陷病毒，阻碍其侵 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
染免疫细胞MT4。
1.2.1.4 抗氧化作用
氧化还原反应是机体新陈代谢的重要组成部分，但过多的活性自由基或自由基消除缓慢，自由基产生的脂质过氧化物就会损害细胞、器官，机体加速衰老并且诱发一系列疾病。周文丽等[17]通过对贻贝多糖的研究发现，贻贝多糖能够大幅地提高血清中的SOD水平，达到降低MAD水平的效果，起到抗氧化功效。
1.2.1.5 其他活性
除此以外，多糖还具有降血糖、降血脂、抗炎、抗衰老抗辐射等作用，近年来，随着对多糖的深入研究，根据贝类多糖的保湿性特点，还将其运用到化妆品行业，在一定程度上拓展了贝类多糖的研究方向，给人们研究多糖提供了新的思路。
1.2.2 国内外研究现状
在60年代，多糖被普遍认为在生命有机体内的作用大大不如蛋白质和核酸，一直处于被忽视的地位。近几十年来，随着研究人员对分子生物学及糖化学的深入研究，人们对多糖有了一定程度上的认识。多糖凭借其与免疫调节系统、细胞间的识别、癌症诊疗的紧密关系引起了医药界和分子生物界的强烈关注。如在抗癌方面，Kodama等[18]通过实验研究发现了从Grifola frondosa中提取得到的多糖有抑制肿瘤细胞的功效。在医药方面，卢传亮等[19]通过对马氏珠母贝多糖的分离纯化及保湿性研究，证实了该种多糖具有高于常规保湿剂的保湿功效。
多糖的活性与其结构有着密切关系。多糖的结构极其复杂，而且不同来源的多糖其结构和组成成分也有所不同，目前对多糖结构的研究主要集中在对其一级结构的研究，二级结构和空间结构方面较少[20]。于广利[21]等证实灰树花菌丝体碱溶性多糖有葡萄糖、甘露糖和木糖组成，其主链由6个α-1,3-D-Glc和2个α-1,3-D-Man构成，且主链α-1,3-D-Glc残基0-4位有两个分支，其中一个分支连接3个β-1,4-D-Glc，另一分支连接一个α-1,4-D-Xyl，一个支链由β-1,4-葡聚糖组成，另一个支链由α-1,4-木糖组成。
在研究多糖活性和结构的基础上，人们还发现对多糖进行特定的结构修饰能产或提高多糖的某些生物活性。
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