响应面法优化通关藤多糖的提取
摘要：为探索通关藤多糖最佳提取条件，本实验通过单因素试验和Box-Behnken中心组合试验设计，考察在超声波环境下提取温度、液料比及超声时间等工艺参数对通关藤多糖提取率的影响，并对通关藤多糖提取工艺条件进行优化。运用比色法测定和分析不同产地通关藤药材中多糖的含量。研究结果表明：通关藤多糖最佳提取工艺参数是：提取温度65℃，液料比31:1mL·g-1，提取时间125 min。响应面法对通关藤多糖的提取条件优化合理可行，为提高多糖的提取率提供了依据。不同产地通关藤药材中多糖平均含量在1.59%～9.10%之间，产地间含量差异较大，四川省德昌县样品三种化学成分的含量最高。
目录
摘要1
关键词1
引言（或绪论）1
1材料与方法1
1.1材料 1
1.1.1材料与试剂 1
1.1.2 仪器与设备1
1.2方法 1
1.2.1 标准曲线的绘制2
1.2.2 通关藤多糖提取工艺2
1.2.3 多糖含量的测定2
1.2.4 超声波提取通关藤多糖单因素实验2
1.2.5 超声波提取通关藤多糖响应面实验设计2
1.2.6 不同产地通关藤中的多糖含量分析2
2 结果与分析3
2.1 标准曲线3
2.2 单因素实验3
2.2.1 提取温度对多糖提取率的影响3
2.2.2 提取时间对多糖提取率的影响3
2.2.3 料液比对多糖提取率的影响3
2.3 模型预测及统计分析4
2.4 两因素交互作用分析6
2.4.1提取温度—料液比的相互关系6
2.4.2提取温度—提取时间的相互关系6
2.4.3提取时间—液料比的相互关系7
2.5 提取参数优化及模型验证7
2.6 不同产地通关藤中的多糖含量分析7
3 讨论7致谢8
参考文献8
Abstract9
引言
通关藤多糖提取工艺优化及含量测定
学生 李岚
通
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
关藤Marsdeniae tenacissimae为萝藦科牛奶菜属植物通关藤的藤茎，其主要药用成分为C21甾体皂苷类，并富含醇类、萜类、多糖、有机酸等化合物，具有清热解毒、止咳平喘、散结止痛，抗癌等功效[1]。目前以通关藤为主要材料所制成的注射剂和片剂对于治疗肺癌、食道癌、胃癌、直肠癌等恶性肿瘤效果良好[2,3]。现在对通关藤的研究主要集中于对甾体苷类、三萜类化合物的等方面的研究，但对多糖成分却鲜有报道。多项研究表明，多糖是一类具有多种生物活性功能的高分子化合物，在临床上对肿瘤、肝炎及神经衰弱均有一定疗效[46]。现代研究也证明，多糖除具有抗氧化、抗病毒、抗辐射、抗肿瘤、抗疲劳及调节免疫细胞等生物活性外，还具有抗凝血、抗血栓、降血糖、降血脂、延缓衰老等特性，甚至对艾滋病病毒也有一定的防御功能[7,8]。作为天然生物活性成分，多糖广泛的治疗特性备受人们的喜爱和关注，因此对通关藤所含多糖成分的研究有实际意义。本实验采用超声波辅助提取通关藤多糖，以多糖提取率为响应值，在单因素实验基础上，进行提取温度、液料比和提取时间的中心组合实验，拟合出多元线性回归方程，以获得通关藤多糖提取的最佳工艺及其参数，并分析不同产地通关藤多糖含量的差异，为通关藤多糖类成分的开发利用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 材料与试剂 2013年4月至7月，从四川、贵州、广西和云南4省份10地区采集野生状态的通关藤样本，经大学中药材研究所郭巧生教授鉴定为通关藤（Marsdenia tenacissima）。实验试剂：石油醚、无水乙醇、95%乙醇、葡萄糖、浓硫酸均为国产分析纯试剂；重蒸苯酚购自北京索莱宝生物科技有限公司；活性炭、3,5二硝基水杨酸均购自Sigma公司。
1.1.2 仪器与设备 XMTD8222型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；5810 R型台式高速冷冻离心机(eppendorf 中国有限公司)；Alpha1506型紫外可见分光光度计（上海谱元仪器有限公司）；FZ 102型微型植物试样粉碎机（北京市永光明医疗仪器厂）；PS60 A型数控超声波清洗器（东莞市洁康超声波设备有限公司）；HHS型水浴锅（巩义市苏华仪器有限责任公司）；
ARA 520型电子天平(上海奥豪斯仪器有限公司)。
1.2 方法
1.2.1标准曲线的绘制 精密吸取浓度为0.10 mgmL1的葡萄糖标准溶液0.1、0.2、0.5、0.7、0.9、1.3 、1.5、1.9 mL至25 mL试管中，用蒸馏水补足至20 mL，再加入1.0 mL 5%苯酚溶液，充分混匀，最后加入5.0 mL浓H2SO4。取 2 mL蒸馏水加入苯酚、浓硫酸，作为空白对照溶液。室温下显色30 min后于分光光度计上测定A490。以糖浓度为横坐标，490 nm处的光吸收值A490为纵坐标，绘制糖浓度光吸收值标准曲线并回归出相应的线性方程。
1.2.2通关藤多糖提取工艺流程 通关藤粉末10 g(孔径0.5 mm)→石油醚索式提取器回流脱脂(液料比4:1，时间2h)→55℃烘干→80%乙醇索式提取器回流去小分子糖、苷类、生物碱等(液料比4:1，时间4h)→55℃烘干→研磨→所得粉末分3份，每份1 g加适当水在一定的温度下进行水浴超声震荡浸提一定时间→离心(8000 rmin1，15min)除去水不溶性淀粉→集上清加活性炭(0.05 g)脱色→离心(8000 rmin1，15 min)→上清加4倍量无水乙醇至乙醇浓度为80%→静置24h→离心(4000rmin1，20 min)→粗多糖TEP
1.2.3多糖含量的测定
将离心所得粗多糖挥干乙醇后加蒸馏水复溶，4000 rmin1离心20 min后取上清液测定多糖含量。样品中总糖含量的测定采用苯酚硫酸法，苯酚硫酸法是一种常见的测量多糖含量的方法。它的原理是多糖类成分在硫酸强烈的脱水作用下分解成单糖，单糖继续反应迅速生成糖醛衍生物，糖醛衍生物与苯酚生成带有颜色的化合物。然后进一步用比色法测量其吸光度，对比标准曲线，可以得到多糖的含量。
1.2.4超声波提取通关藤多糖单因素实验 为了确定超声提取中温度、提取时间和液料比三个条件的最佳范围，进行单因素实验。
目录
摘要1
关键词1
引言（或绪论）1
1材料与方法1
1.1材料 1
1.1.1材料与试剂 1
1.1.2 仪器与设备1
1.2方法 1
1.2.1 标准曲线的绘制2
1.2.2 通关藤多糖提取工艺2
1.2.3 多糖含量的测定2
1.2.4 超声波提取通关藤多糖单因素实验2
1.2.5 超声波提取通关藤多糖响应面实验设计2
1.2.6 不同产地通关藤中的多糖含量分析2
2 结果与分析3
2.1 标准曲线3
2.2 单因素实验3
2.2.1 提取温度对多糖提取率的影响3
2.2.2 提取时间对多糖提取率的影响3
2.2.3 料液比对多糖提取率的影响3
2.3 模型预测及统计分析4
2.4 两因素交互作用分析6
2.4.1提取温度—料液比的相互关系6
2.4.2提取温度—提取时间的相互关系6
2.4.3提取时间—液料比的相互关系7
2.5 提取参数优化及模型验证7
2.6 不同产地通关藤中的多糖含量分析7
3 讨论7致谢8
参考文献8
Abstract9
引言
通关藤多糖提取工艺优化及含量测定
学生 李岚
通
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
关藤Marsdeniae tenacissimae为萝藦科牛奶菜属植物通关藤的藤茎，其主要药用成分为C21甾体皂苷类，并富含醇类、萜类、多糖、有机酸等化合物，具有清热解毒、止咳平喘、散结止痛，抗癌等功效[1]。目前以通关藤为主要材料所制成的注射剂和片剂对于治疗肺癌、食道癌、胃癌、直肠癌等恶性肿瘤效果良好[2,3]。现在对通关藤的研究主要集中于对甾体苷类、三萜类化合物的等方面的研究，但对多糖成分却鲜有报道。多项研究表明，多糖是一类具有多种生物活性功能的高分子化合物，在临床上对肿瘤、肝炎及神经衰弱均有一定疗效[46]。现代研究也证明，多糖除具有抗氧化、抗病毒、抗辐射、抗肿瘤、抗疲劳及调节免疫细胞等生物活性外，还具有抗凝血、抗血栓、降血糖、降血脂、延缓衰老等特性，甚至对艾滋病病毒也有一定的防御功能[7,8]。作为天然生物活性成分，多糖广泛的治疗特性备受人们的喜爱和关注，因此对通关藤所含多糖成分的研究有实际意义。本实验采用超声波辅助提取通关藤多糖，以多糖提取率为响应值，在单因素实验基础上，进行提取温度、液料比和提取时间的中心组合实验，拟合出多元线性回归方程，以获得通关藤多糖提取的最佳工艺及其参数，并分析不同产地通关藤多糖含量的差异，为通关藤多糖类成分的开发利用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 材料与试剂 2013年4月至7月，从四川、贵州、广西和云南4省份10地区采集野生状态的通关藤样本，经大学中药材研究所郭巧生教授鉴定为通关藤（Marsdenia tenacissima）。实验试剂：石油醚、无水乙醇、95%乙醇、葡萄糖、浓硫酸均为国产分析纯试剂；重蒸苯酚购自北京索莱宝生物科技有限公司；活性炭、3,5二硝基水杨酸均购自Sigma公司。
1.1.2 仪器与设备 XMTD8222型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；5810 R型台式高速冷冻离心机(eppendorf 中国有限公司)；Alpha1506型紫外可见分光光度计（上海谱元仪器有限公司）；FZ 102型微型植物试样粉碎机（北京市永光明医疗仪器厂）；PS60 A型数控超声波清洗器（东莞市洁康超声波设备有限公司）；HHS型水浴锅（巩义市苏华仪器有限责任公司）；
ARA 520型电子天平(上海奥豪斯仪器有限公司)。
1.2 方法
1.2.1标准曲线的绘制 精密吸取浓度为0.10 mgmL1的葡萄糖标准溶液0.1、0.2、0.5、0.7、0.9、1.3 、1.5、1.9 mL至25 mL试管中，用蒸馏水补足至20 mL，再加入1.0 mL 5%苯酚溶液，充分混匀，最后加入5.0 mL浓H2SO4。取 2 mL蒸馏水加入苯酚、浓硫酸，作为空白对照溶液。室温下显色30 min后于分光光度计上测定A490。以糖浓度为横坐标，490 nm处的光吸收值A490为纵坐标，绘制糖浓度光吸收值标准曲线并回归出相应的线性方程。
1.2.2通关藤多糖提取工艺流程 通关藤粉末10 g(孔径0.5 mm)→石油醚索式提取器回流脱脂(液料比4:1，时间2h)→55℃烘干→80%乙醇索式提取器回流去小分子糖、苷类、生物碱等(液料比4:1，时间4h)→55℃烘干→研磨→所得粉末分3份，每份1 g加适当水在一定的温度下进行水浴超声震荡浸提一定时间→离心(8000 rmin1，15min)除去水不溶性淀粉→集上清加活性炭(0.05 g)脱色→离心(8000 rmin1，15 min)→上清加4倍量无水乙醇至乙醇浓度为80%→静置24h→离心(4000rmin1，20 min)→粗多糖TEP
1.2.3多糖含量的测定
将离心所得粗多糖挥干乙醇后加蒸馏水复溶，4000 rmin1离心20 min后取上清液测定多糖含量。样品中总糖含量的测定采用苯酚硫酸法，苯酚硫酸法是一种常见的测量多糖含量的方法。它的原理是多糖类成分在硫酸强烈的脱水作用下分解成单糖，单糖继续反应迅速生成糖醛衍生物，糖醛衍生物与苯酚生成带有颜色的化合物。然后进一步用比色法测量其吸光度，对比标准曲线，可以得到多糖的含量。
1.2.4超声波提取通关藤多糖单因素实验 为了确定超声提取中温度、提取时间和液料比三个条件的最佳范围，进行单因素实验。
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