克氏原螯虾螃蟹肠道益生菌的分离与鉴定(附件)
克氏原螯虾、螃蟹肠道益生菌的分离与鉴定为了实现可持续发展的生态水产养殖，本实验从人工养殖的克氏原螯虾和螃蟹的肠道中分离益生菌。用菌落形态特征观察、生理生化试验初步鉴定分离得到的菌株，结果为10株益生菌，分别为5株乳酸菌和5株芽孢杆菌。经16S rDNA序列分析最终鉴定为5株益生菌，分别为肠膜明串珠菌、发酵乳杆菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和死谷芽孢杆菌。克氏原螯虾和螃蟹为重要的水产养殖动物，从其肠道内分离出的益生菌具有本身生物安全性和高效性，可以为后期开发益生菌制剂在水产饲料中的应用奠定基础。关键词 益生菌；肠道；鉴定；水产养殖
目录
1. 引言 1
1.1 肠道微生物概述 1
1.2 常见益生菌株 2
1.3 益生菌在水产中的应用 2
1.3.1 抑制有害细菌 2
1.3.2 提高宿主的免疫力 3
1.3.3 改善宿主的营养与代谢情况 3
1.3.4 改善肉质 3
1.4 课题研究的目的以及意义 4
2. 实验材料及仪器 4
2.1 实验原料 4
2.2 培养基 4
2.3 主要试剂 5
2.4 主要仪器设备 6
3. 试验方法 6
3.1 细菌分离 6
3.1.1 样品的采集 6
3.1.2 乳酸菌的分离 6
3.1.3 芽孢杆菌的分离 7
3.2 细菌鉴定 7
3.2.1 菌落形态测定 7
3.2.2 革兰氏染色法 7
3.2.3 接触酶试验 8
3.2.4 淀粉水解试验 8
3.2.5 明胶液化试验 8
3.2.6 糖发酵试验 8
3.2.7 菌株分子生物学鉴定 8
4. 结果与分析 10
4.1 筛选结果 10
4.2 菌株鉴定 11
4.2.1 乳酸菌鉴定 11
4.2.2 芽孢杆菌鉴定 15
5. 讨论 18
参考文献 20
致 谢 23
附 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
录 24
引言
肠道微生物概述
肠道内有着数量非常巨大的细菌，它们一般被分为三类：中性菌、益生菌和有害菌。中性菌是指细菌可能会对宿主产生多重作用，一般情况下有益于机体的健康，但是如果爆发不受控制的增长或者从消化道转移到体内其他的器官，就有可能导致多种问题的发生[1]。益生菌，它可以帮助机体合成多种维生素，参加帮助机体消化食物，促进肠道的蠕动，抑制病原菌群的生存，有助于分解对机体有毒、有害的物质等。有害菌是指一旦数目失去控制得到大量增殖，就会有可能引起生物体的各种疾病，影响机体免疫系统功能，或者会产生致癌物质等对机体有害的物质。宿主的健康与否与寄居在肠道内的益生菌群结构有着不可分割的关系。在肠道菌群的长时间的演变中，随着宿主对环境的适应以及自然选择，不同类型的微生物群落之间，宿主和微生物群落之间，微生物群落、宿主和环境之间相互依靠，形成一个相互制约的体系，这个体系总是处于相对动态平衡的状态[2]。所以在一般的情况下，菌群结构可以保持一个相对于比较稳定的状态，对宿主的表现也不具有致病性。宿主与其肠道内的微生物之间的互相关系对健康养殖水产动物也有着非常重要的影响[3，4]。大量的研究发现肠道内的菌群能够帮助和促进机体对病原菌具有拮抗性、增强机体的免疫力以及吸收营养物质，但是菌群结构发生改变有可能造成宿主各种消化道疾病[5，6]。
凭借着细菌在宿主肠道内的定居时间和依附力，肠道内的菌群大体上可以分为过路菌群和常驻菌群。过路菌群是指那些个不能够在健康动物的肠道中长期生存的微生物，除非他们占据固定菌群的特定生存区域；常驻菌群是指那些占据着肠道内某一固定区域的微生物。有研究表明，大部分在消化道内长期稳定生长的菌群可能为益生菌。在免疫系统不健全和消化道发育不完善的幼体阶段，水生动物就开始从它生活的水里寻找食物[7，8]，水中的细菌会随着食物不断地进入到宿主体内，并且能够形成多种多样的微生物群落。所以，在这段时间内水产动物消化道内的微生物能够伴随着水中微生物的转换从而迅速改变[9]。虽然大部分消化道内的细菌仅仅是在消化道内短暂停留，可以伴随着宿主的排泄再次排入水体，但是不得不承认的是会有一定种类和数目的细菌会存在肠道内作为肠道的“土著菌”[10]。有研究表明，对宿主有害的比如伤寒沙氏门菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌、结核分枝杆菌等细菌为过路菌群。所有的虾的消化道中都存在着一定数量的乳酸杆菌、双歧杆菌，这些菌是常驻菌群，这类菌通常对虾的肠道有利。大量研究指出，常驻菌群是过路菌群不能在宿主肠道生存的重要原因，因此常住菌比如嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌等是使过路菌等致病菌数目很少，宿主健康的主要原因。
常见益生菌株
目前已经发现的益生菌主要有乳杆菌、双歧杆菌、拟杆菌、光合菌、放线菌、芽孢杆菌、米曲霉菌和酵母菌等，大多属于细菌、真菌、微藻等，它们具备三个的基本特征：迅速得分解有机物质或体外实验能够拮抗病原菌；可以在养殖水体、养殖动物的消化道中生存；在宿主感染实验里可以增强宿主对致病菌的抵抗力，有利于宿主的成长[11，12]。
目前世界上多数国家会使用一些来自于人体肠道的双歧杆菌和乳酸菌比如：罗氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、酪乳杆菌、植物乳酸杆菌、詹氏乳酸杆菌、短双歧杆菌、长双歧杆菌等益生菌来发酵酸奶。除此此外也会使用乳酸肠球菌。
芽孢杆菌可以用芽孢休眠体的方式存活，存活机率非常之高，方便保存。芽孢杆菌具有非常强大的生命力，在4065℃的恶劣温度环境下也可生长[13]。
目前益生菌大多会被用来替代抗生素或者作为疾病控制剂应用于水产养殖动物的疾病防治中。酵母、微藻、革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌大部分已经被作为益生菌从而广泛地应用于甲壳类和鱼类的养殖中[14]。
益生菌在水产中的应用
多年来，利用益生菌代替在水产饲料中添加的抗生素得到了人们密切的关注。益生菌和含有益生菌的产品的使用可以产生与使用抗生素相同的效果[15]， 这是一个令人心动的选择，能够有效得避免滥用抗生素带来的后果。
益生菌在水产动物养殖中可以起到多种作用，既能够单独得起作用，又能够几种一起互相作用，互相影响。这些作用大体上包括抑制有害细菌，提高宿主的免疫力，改善宿主的营养与代谢情况以及改善肉质等方面。
目录
1. 引言 1
1.1 肠道微生物概述 1
1.2 常见益生菌株 2
1.3 益生菌在水产中的应用 2
1.3.1 抑制有害细菌 2
1.3.2 提高宿主的免疫力 3
1.3.3 改善宿主的营养与代谢情况 3
1.3.4 改善肉质 3
1.4 课题研究的目的以及意义 4
2. 实验材料及仪器 4
2.1 实验原料 4
2.2 培养基 4
2.3 主要试剂 5
2.4 主要仪器设备 6
3. 试验方法 6
3.1 细菌分离 6
3.1.1 样品的采集 6
3.1.2 乳酸菌的分离 6
3.1.3 芽孢杆菌的分离 7
3.2 细菌鉴定 7
3.2.1 菌落形态测定 7
3.2.2 革兰氏染色法 7
3.2.3 接触酶试验 8
3.2.4 淀粉水解试验 8
3.2.5 明胶液化试验 8
3.2.6 糖发酵试验 8
3.2.7 菌株分子生物学鉴定 8
4. 结果与分析 10
4.1 筛选结果 10
4.2 菌株鉴定 11
4.2.1 乳酸菌鉴定 11
4.2.2 芽孢杆菌鉴定 15
5. 讨论 18
参考文献 20
致 谢 23
附 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
录 24
引言
肠道微生物概述
肠道内有着数量非常巨大的细菌，它们一般被分为三类：中性菌、益生菌和有害菌。中性菌是指细菌可能会对宿主产生多重作用，一般情况下有益于机体的健康，但是如果爆发不受控制的增长或者从消化道转移到体内其他的器官，就有可能导致多种问题的发生[1]。益生菌，它可以帮助机体合成多种维生素，参加帮助机体消化食物，促进肠道的蠕动，抑制病原菌群的生存，有助于分解对机体有毒、有害的物质等。有害菌是指一旦数目失去控制得到大量增殖，就会有可能引起生物体的各种疾病，影响机体免疫系统功能，或者会产生致癌物质等对机体有害的物质。宿主的健康与否与寄居在肠道内的益生菌群结构有着不可分割的关系。在肠道菌群的长时间的演变中，随着宿主对环境的适应以及自然选择，不同类型的微生物群落之间，宿主和微生物群落之间，微生物群落、宿主和环境之间相互依靠，形成一个相互制约的体系，这个体系总是处于相对动态平衡的状态[2]。所以在一般的情况下，菌群结构可以保持一个相对于比较稳定的状态，对宿主的表现也不具有致病性。宿主与其肠道内的微生物之间的互相关系对健康养殖水产动物也有着非常重要的影响[3，4]。大量的研究发现肠道内的菌群能够帮助和促进机体对病原菌具有拮抗性、增强机体的免疫力以及吸收营养物质，但是菌群结构发生改变有可能造成宿主各种消化道疾病[5，6]。
凭借着细菌在宿主肠道内的定居时间和依附力，肠道内的菌群大体上可以分为过路菌群和常驻菌群。过路菌群是指那些个不能够在健康动物的肠道中长期生存的微生物，除非他们占据固定菌群的特定生存区域；常驻菌群是指那些占据着肠道内某一固定区域的微生物。有研究表明，大部分在消化道内长期稳定生长的菌群可能为益生菌。在免疫系统不健全和消化道发育不完善的幼体阶段，水生动物就开始从它生活的水里寻找食物[7，8]，水中的细菌会随着食物不断地进入到宿主体内，并且能够形成多种多样的微生物群落。所以，在这段时间内水产动物消化道内的微生物能够伴随着水中微生物的转换从而迅速改变[9]。虽然大部分消化道内的细菌仅仅是在消化道内短暂停留，可以伴随着宿主的排泄再次排入水体，但是不得不承认的是会有一定种类和数目的细菌会存在肠道内作为肠道的“土著菌”[10]。有研究表明，对宿主有害的比如伤寒沙氏门菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌、结核分枝杆菌等细菌为过路菌群。所有的虾的消化道中都存在着一定数量的乳酸杆菌、双歧杆菌，这些菌是常驻菌群，这类菌通常对虾的肠道有利。大量研究指出，常驻菌群是过路菌群不能在宿主肠道生存的重要原因，因此常住菌比如嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌等是使过路菌等致病菌数目很少，宿主健康的主要原因。
常见益生菌株
目前已经发现的益生菌主要有乳杆菌、双歧杆菌、拟杆菌、光合菌、放线菌、芽孢杆菌、米曲霉菌和酵母菌等，大多属于细菌、真菌、微藻等，它们具备三个的基本特征：迅速得分解有机物质或体外实验能够拮抗病原菌；可以在养殖水体、养殖动物的消化道中生存；在宿主感染实验里可以增强宿主对致病菌的抵抗力，有利于宿主的成长[11，12]。
目前世界上多数国家会使用一些来自于人体肠道的双歧杆菌和乳酸菌比如：罗氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、酪乳杆菌、植物乳酸杆菌、詹氏乳酸杆菌、短双歧杆菌、长双歧杆菌等益生菌来发酵酸奶。除此此外也会使用乳酸肠球菌。
芽孢杆菌可以用芽孢休眠体的方式存活，存活机率非常之高，方便保存。芽孢杆菌具有非常强大的生命力，在4065℃的恶劣温度环境下也可生长[13]。
目前益生菌大多会被用来替代抗生素或者作为疾病控制剂应用于水产养殖动物的疾病防治中。酵母、微藻、革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌大部分已经被作为益生菌从而广泛地应用于甲壳类和鱼类的养殖中[14]。
益生菌在水产中的应用
多年来，利用益生菌代替在水产饲料中添加的抗生素得到了人们密切的关注。益生菌和含有益生菌的产品的使用可以产生与使用抗生素相同的效果[15]， 这是一个令人心动的选择，能够有效得避免滥用抗生素带来的后果。
益生菌在水产动物养殖中可以起到多种作用，既能够单独得起作用，又能够几种一起互相作用，互相影响。这些作用大体上包括抑制有害细菌，提高宿主的免疫力，改善宿主的营养与代谢情况以及改善肉质等方面。
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