江瑶柱粗多糖的分离纯化(附件)
本研究的目的是分离纯化江瑶柱粗多糖并对其结构进行初步分析。采用DEAE-52纤维素柱进行离子交换层析，依据不同组分所带电量的不同，从而分离纯化江瑶柱粗多糖（DSCP-C），得到四种纯化组分（DSCP-1、DSCP-2、DSCP-3、DSCP-4）。按照糖腈乙酸酯衍生物的气相色谱法、考马斯亮蓝法、硫酸-间羟联苯法、氯化钡-明胶比色法分别测定了粗多糖及纯化组分中单糖组成、蛋白质、糖醛酸、硫酸基的含量，结果表明粗多糖（DSCP-C）和纯化组分DSCP-1、DSCP-2、DSCP-3、DSCP-4中单糖主要是葡萄糖，另外蛋白质的含量分别是1.13%、0.37%、1.08%、0.66%、0.97%，糖醛酸的含量分别是0.64%、3.16%、6.46%、8.07%、8.25%，硫酸基的含量分别是0.08%、1.08%、1.93%、2.82%、3.95%。采取高效液相色谱法、紫外分析、红外分析，对江瑶柱多糖的结构进行初步分析。研究结果对深入了解江瑶柱多糖的结构及其生物学功能具有重要的意义。关键词 江瑶柱，多糖，纯化，结构分析
目 录
1 引言 1
1.1 江瑶柱的简介 1
1.2 多糖的简介 1
1.3 多糖的分离纯化方法 1
1.4 纯化后多糖的结构分析 1
1.5 本课题的研究目的与意义 2
2 实验原料、试剂及仪器 3
2.1 主要实验原料 3
2.2 主要实验试剂 3
2.3 主要实验仪器 4
3 实验方案 4
3.1 江瑶柱多糖分离纯化 4
3.2 江瑶柱多糖结构分析 6
4 实验结果与分析 10
4.1 纯化多糖样品的结构分析 10
结 论 20
致 谢 21
参 考 文 献 22
1 引言
1.1 江瑶柱的简介
江瑶柱是扇贝的干制品，又称干贝，因为其形如牛耳就称之为牛耳螺，壳薄肉厚，肉质鲜与嫩和美味可口，为海中珍品。古人曰：食后三日，犹觉鸡虾乏味，可见干贝之鲜美非同一般。 另外江瑶柱也具有很高的营养价值，富含维生素 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
与蛋白质，还含有丰富的牛磺酸[1]。因此，江瑶柱是很好的滋补产品。
1.2 多糖的简介
多糖又可以称为多聚糖，是一种链状聚合物，由醛糖和酮糖脱水形成，并被糖苷键线性或分枝连接形成。作为生物性聚合物，它分布极为广泛。因而种类也很多，根据来源可分为动物、植物、真菌、细菌多糖和藻类地衣多糖这五类[2]。近代以来，随着分子生物学和糖化学的发展研究的深入，多糖越来越被人们认识。大量数据表明，许多多糖都有抗肿瘤、抗衰老、降血糖血脂、提高免疫力等功能[3]且非常安全。
随着人们对生物多糖资源的研究及发展，多糖的生物活性功能被广泛运用于功能食品和临床方面，医药界和分子生物界越来越重视多糖的研究，因为其与免疫系统调节、细胞间的识别、癌症诊疗的紧密关系而备受瞩目。现在人们可以利用现有技术从天然产物里分离提取多糖类化合物300多种[4]。
然而贝类多糖分类繁杂，最主要的有两个原因，第一组成多糖的单糖品种多，第二连接方式不同(有无支链)也会导致同一单糖组成的多糖其结构和功能也不同[5]。因此，贝类多糖这个领域有广阔的发展前景。
1.3 多糖的分离纯化方法
自然界中多糖种类繁杂，为了得到较为纯净的多糖，必须要对多糖混合物进行提纯。根据多糖性质的不同，选取23种在实验室中较为常用的的分离方法结合起来，所得的分离结果会比较好。比如：乙醇分步沉淀法、冻融分级法、膜分离法、色谱法等。就目前而言，柱色谱法从各个方面而言都是最合适，效果最好的分离方法。柱层析也可以鉴定多糖的纯度[6]。分离多糖的时候，一般有两个步骤，第一线过柱洗脱，第二根据洗脱液浓度收集洗脱液，最后收集分离得到各个单一的纯化组分[7]。
1.4 纯化后多糖的结构分析
1.4.1 纯度、分子量的分析方法
本实验中运用高效液相色谱法来测定纯化多糖的纯度以及分子量。实验中先将样品溶液作为流动相泵入色谱柱中，让样品溶液中的不同组分与仪器中的固定相充分接触，发生相互作用。由于样品溶液中各组分性质和结构的不同，因此被固定相保留的时间也不同，这也就出现了按一定顺序从固定相中流出，因而得到高效液相色谱图。对色谱图进行分析，根据峰面积，出峰时间等数据可以判断样品提纯效果。在分离分析实验中，由于其分离效率高、选择性好、检测灵敏度高、操作自动化的优点而被广泛应用。本实验采用此方法以检验纯化组分的纯度及不同种类多糖的分子量的区别。
1.4.2 单糖组成的分析方法
按照Luo[8]等报道糖腈乙酸酯衍生物的气相色谱法对多糖样品的单糖组成进行测定。将标准单糖糖腈衍生化后的气相色谱图与江瑶柱粗多糖水解后经衍生化处理的气相色谱图对照，根据出峰时间可以判断单糖种类。
1.4.3 蛋白质含量的分析方法
因考马斯亮蓝法的灵敏度高、测定快速、简便、干扰物质少，所以本实验用此法测定蛋白质含量。考马斯亮蓝G250染料在酸性溶液中与蛋白质结合，最大吸光度会随着染料和蛋白质结合而改变，此时吸光度与蛋白质浓度呈正比，而且生成物的颜色在1 h基本稳定，便于实验测定吸光度。
1.4.4 糖醛酸含量的分析方法
用硫酸间羟联苯法测糖醛酸含量。利用多糖水解生成的多聚己糖醛酸、和含四硼酸钠溶液在高温下发生缩合反应，然后和间羟联苯反应，产生紫红色的衍生物。由于在一定浓度范围，该物质的吸光度和糖醛酸含量存在线性关系，因而可以采用比色法计算糖醛酸含量 [9,10]。
1.4.5 硫酸基含量的分析方法
用硫酸基含量来判断多糖是否是酸性。由于硫酸钡沉淀能够使样品在静置时吸光度变小，因而利用氯化钡与明胶相互作用，生成硫酸钡沉淀，测得不同样品中的硫酸基含量，从而判断多糖是否是酸性。
1.4.6 紫外光谱分析
紫外分光光度法是是根据被测物质的不同浓度在紫外可见光区的某一波长下或者在某一波长范围内吸光度的不同来对物质进行定量或定性分析的试验方法。本实验中用此方法来判断多糖组分中是否存在核酸或者蛋白质。
1.4.7 红外光谱分析
红外光谱分析是利用红外光谱对物质分子进行分析和鉴定。用一束不同波长不同的红外射线照射在物质上，因为在不同的波长区域中，物质大分子、原子因其组成和结构不同而吸收峰不同，可以得到红光谱图，据此来对分子的结构进行初步的分析和鉴定。所以在对多糖的结构进行研究时可以利用红外光谱分析，确定糖苷键和糖构型、识别吡喃糖和呋喃糖、分析单糖种类及糖链上主要取代基[11]。
目 录
1 引言 1
1.1 江瑶柱的简介 1
1.2 多糖的简介 1
1.3 多糖的分离纯化方法 1
1.4 纯化后多糖的结构分析 1
1.5 本课题的研究目的与意义 2
2 实验原料、试剂及仪器 3
2.1 主要实验原料 3
2.2 主要实验试剂 3
2.3 主要实验仪器 4
3 实验方案 4
3.1 江瑶柱多糖分离纯化 4
3.2 江瑶柱多糖结构分析 6
4 实验结果与分析 10
4.1 纯化多糖样品的结构分析 10
结 论 20
致 谢 21
参 考 文 献 22
1 引言
1.1 江瑶柱的简介
江瑶柱是扇贝的干制品，又称干贝，因为其形如牛耳就称之为牛耳螺，壳薄肉厚，肉质鲜与嫩和美味可口，为海中珍品。古人曰：食后三日，犹觉鸡虾乏味，可见干贝之鲜美非同一般。 另外江瑶柱也具有很高的营养价值，富含维生素 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
与蛋白质，还含有丰富的牛磺酸[1]。因此，江瑶柱是很好的滋补产品。
1.2 多糖的简介
多糖又可以称为多聚糖，是一种链状聚合物，由醛糖和酮糖脱水形成，并被糖苷键线性或分枝连接形成。作为生物性聚合物，它分布极为广泛。因而种类也很多，根据来源可分为动物、植物、真菌、细菌多糖和藻类地衣多糖这五类[2]。近代以来，随着分子生物学和糖化学的发展研究的深入，多糖越来越被人们认识。大量数据表明，许多多糖都有抗肿瘤、抗衰老、降血糖血脂、提高免疫力等功能[3]且非常安全。
随着人们对生物多糖资源的研究及发展，多糖的生物活性功能被广泛运用于功能食品和临床方面，医药界和分子生物界越来越重视多糖的研究，因为其与免疫系统调节、细胞间的识别、癌症诊疗的紧密关系而备受瞩目。现在人们可以利用现有技术从天然产物里分离提取多糖类化合物300多种[4]。
然而贝类多糖分类繁杂，最主要的有两个原因，第一组成多糖的单糖品种多，第二连接方式不同(有无支链)也会导致同一单糖组成的多糖其结构和功能也不同[5]。因此，贝类多糖这个领域有广阔的发展前景。
1.3 多糖的分离纯化方法
自然界中多糖种类繁杂，为了得到较为纯净的多糖，必须要对多糖混合物进行提纯。根据多糖性质的不同，选取23种在实验室中较为常用的的分离方法结合起来，所得的分离结果会比较好。比如：乙醇分步沉淀法、冻融分级法、膜分离法、色谱法等。就目前而言，柱色谱法从各个方面而言都是最合适，效果最好的分离方法。柱层析也可以鉴定多糖的纯度[6]。分离多糖的时候，一般有两个步骤，第一线过柱洗脱，第二根据洗脱液浓度收集洗脱液，最后收集分离得到各个单一的纯化组分[7]。
1.4 纯化后多糖的结构分析
1.4.1 纯度、分子量的分析方法
本实验中运用高效液相色谱法来测定纯化多糖的纯度以及分子量。实验中先将样品溶液作为流动相泵入色谱柱中，让样品溶液中的不同组分与仪器中的固定相充分接触，发生相互作用。由于样品溶液中各组分性质和结构的不同，因此被固定相保留的时间也不同，这也就出现了按一定顺序从固定相中流出，因而得到高效液相色谱图。对色谱图进行分析，根据峰面积，出峰时间等数据可以判断样品提纯效果。在分离分析实验中，由于其分离效率高、选择性好、检测灵敏度高、操作自动化的优点而被广泛应用。本实验采用此方法以检验纯化组分的纯度及不同种类多糖的分子量的区别。
1.4.2 单糖组成的分析方法
按照Luo[8]等报道糖腈乙酸酯衍生物的气相色谱法对多糖样品的单糖组成进行测定。将标准单糖糖腈衍生化后的气相色谱图与江瑶柱粗多糖水解后经衍生化处理的气相色谱图对照，根据出峰时间可以判断单糖种类。
1.4.3 蛋白质含量的分析方法
因考马斯亮蓝法的灵敏度高、测定快速、简便、干扰物质少，所以本实验用此法测定蛋白质含量。考马斯亮蓝G250染料在酸性溶液中与蛋白质结合，最大吸光度会随着染料和蛋白质结合而改变，此时吸光度与蛋白质浓度呈正比，而且生成物的颜色在1 h基本稳定，便于实验测定吸光度。
1.4.4 糖醛酸含量的分析方法
用硫酸间羟联苯法测糖醛酸含量。利用多糖水解生成的多聚己糖醛酸、和含四硼酸钠溶液在高温下发生缩合反应，然后和间羟联苯反应，产生紫红色的衍生物。由于在一定浓度范围，该物质的吸光度和糖醛酸含量存在线性关系，因而可以采用比色法计算糖醛酸含量 [9,10]。
1.4.5 硫酸基含量的分析方法
用硫酸基含量来判断多糖是否是酸性。由于硫酸钡沉淀能够使样品在静置时吸光度变小，因而利用氯化钡与明胶相互作用，生成硫酸钡沉淀，测得不同样品中的硫酸基含量，从而判断多糖是否是酸性。
1.4.6 紫外光谱分析
紫外分光光度法是是根据被测物质的不同浓度在紫外可见光区的某一波长下或者在某一波长范围内吸光度的不同来对物质进行定量或定性分析的试验方法。本实验中用此方法来判断多糖组分中是否存在核酸或者蛋白质。
1.4.7 红外光谱分析
红外光谱分析是利用红外光谱对物质分子进行分析和鉴定。用一束不同波长不同的红外射线照射在物质上，因为在不同的波长区域中，物质大分子、原子因其组成和结构不同而吸收峰不同，可以得到红光谱图，据此来对分子的结构进行初步的分析和鉴定。所以在对多糖的结构进行研究时可以利用红外光谱分析，确定糖苷键和糖构型、识别吡喃糖和呋喃糖、分析单糖种类及糖链上主要取代基[11]。
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