1株海芦笋内生真菌发酵产物化学成分初步研究
1株海芦笋内生真菌发酵产物化学成分初步研究[20200509190531]
摘要：大量研究表明，植物内生真菌能够产生结构新颖、活性多样的次级代谢产物，在医药、食品、农业等领域有广泛的应用，已经成为寻找和发现新化合物的宝贵资源。本研究利用极性及分子量的差异，对一株海芦笋内生真菌橘青霉（Penicillium citrinum）发酵产物中的化合物进行分离和鉴定。利用常压硅胶柱层析、减压硅胶柱层析、sephedex LH-20等分离方法从中分离得到1个单体化合物，通过电喷雾质谱（Electronic Spray Ion– Mass Spectrum）和核磁共振波谱（Nuclear magnetic resonance spectroscopy， NMR）包括1H NMR和13C NMR以及与参考文献数据对比，确定该化合物的化学结构为橘霉素，并对橘霉素的理化性质、来源、毒性、食品中的污染情况、限定标准和检测方法进行了分析和讨论。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
关键字:海芦笋；真菌；分离；橘霉素
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1.1 材料、试剂与仪器 2
1.2 提取分离 3
1.3 流程图 5
2 结果与分析 6
2.1 化合物结构解析 6
2.2 橘霉素 8
2.1.1 橘霉素的抑菌性 8
2.2.2 橘霉素的毒性 8
3 讨论 9
3.1 橘霉素的检测方法 9
3.1.1 高效液相色谱法 10
3.1.2 酶联免疫吸附法 10
3.1.3 薄层层析法 10
3.1.4 高效液相色谱-质谱分析法 11
致谢 11
参考文献 11
1株海芦笋内生真菌发酵产物化学成分初步研究
引言
海芦笋(Salicornia herbacea)学名盐角草，俗称海蓬子或海豆，它是一种鲜美多汁、口感咸脆的绿色时令海水蔬菜。其抗盐能力极高，超过海水盐度的20%～40%，内茎的可溶性盐分含量达37%。海芦笋富含多种活性物质，如胡萝卜素、槲皮素、异鼠、李素芸香苷等[1]。除此之外，海芦笋嫩茎中还含有天然植物盐和植物碱(微角皂甙)，食用后对人体有很多益处：可以中和人体血液中的脂肪酸，清除血管壁上的胆固醇[2]，降低血压，促进肝脏的新陈代谢，提高人体免疫力，还能够预防帕金森病。海芦笋中的提取物具有显著的体外抗氧化活性，与α-生育酚相当。
真菌在自然界中广泛存在，在长期的进化过程中，一些真菌寻找到一个理想的生活环境——植物体，它们进入植 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
物体，并且和谐地与植物生活在一起,成为植物体微生态系统的组成部分[3]。它们生活在植物的根、茎、叶等器官的组织内部，但一般不引起植物体病害，这些真菌我们称之为内生真菌(endophytic fungus)。通过对植物组织进行严格表面消毒，杀死其表面微生物并无菌操作取其内部组织在营养培养基上进行培养，一般可分离、纯化得到它们[4]。
对植物内生真菌研究发现，其次生代谢产物十分丰富，有萜类、生物碱、黄酮、和多炔类等化合物；研究表明植物内生真菌可以产生或促进宿主植物产生某些植物激素，张集慧等研究证明金线莲、墨兰、铁皮石斛、天麻等兰科植物内生真菌能够产生赤霉素、吲哚乙酸、脱落酸、玉米素、玉米素核苷等植物生长调节剂，袁志林等研究发现大戟科植物内生真菌B3分泌吲哚乙酸和脱落酸[5]。禾本科植物内生真菌能够产生多种生物碱，如有机胺类、吡喏里西啶类、麦角碱类等。Ju等从内生真菌感染的一种草熟禾中分离到数个对蚊子幼虫有毒性的黄酮类化合物。顾爱国等从苦皮藤内生真菌中分离到环肽类抗生素eniatinns类化合物，其对番茄早疫病菌、烟草赤星病菌、小麦根腐病菌、玉米大斑病菌4种植物病原真菌菌丝生长和孢子萌发抑制率均大于80%[6]。一些内生真菌能产生细胞壁分解酶，用以克服宿主防御异物的天然屏障，还能产生果胶酶、纤维素酶、酯酶等胞外酶。有些酶具有较高的商业应用价值。以上的种种实例足以说明内生真菌代谢产物十分丰富。
本实验室近年来持续开展了从盐生植物共附生真菌中寻找抗特殊成分的研究。在进行菌株筛选中，从盐生海芦笋中分离到一株真菌橘青霉（Penicillium citrinum）。本研究对该真菌发酵后的发酵产物进行溶剂提取、常压硅胶柱层析、减压硅胶柱层析、sephedex LH-20等分离纯化等得到单体化合物，应用现代波谱学方法解析化合物的结构。
1 材料与方法
1.1 材料、试剂与仪器
真菌8A-2（橘青霉Penicillium citrinum)是从采自盐城大丰港的野生盐生海芦笋中分离得到的，并已经过菌种发酵。
Sephadex LH-20 瑞典Pharmacia公司；硅胶H(200～400目)青岛海洋化工厂产品。常规提取分离用甲醇、丙酮、乙酸乙酯、石油醚、氯仿、环己烷等均为工业用化学纯产品，重蒸后使用。
JNM-ECP600 型核磁共振仪 日本Jeol 公司；Mariner API-TOF 型质谱仪 美国应用生物系统公司；HN101-1A鼓风干燥HN101-1A鼓风干燥箱 上海苏进仪器设备厂监制箱 上海苏进仪器设备厂监制； EYELAN-N型旋转薄膜蒸发仪 日本Rikakikai有限公司。
1.2 提取分离
把20L菌种发酵液用细密的纱布过滤后得到发酵液和菌丝体，随后将发酵液减压浓缩至5L，再加入等体积（浓缩后的体积5L）的乙酸乙酯，先后萃取3次。合并乙酸乙酯提取液、减压浓缩至1L得到发酵液浓缩液，再将菌丝体用等量（与发酵液浓缩液等量为1L）的80%丙酮提取2次，减压浓缩无水后用等量的乙酸乙酯提取3次，合并提取液并减压浓缩至1L得到菌丝体浓缩液，合并发酵液和菌丝体浓缩液减压蒸干得到乙酸乙酯提取总浸膏(22g)，分别用展开剂为石油醚-丙酮（1:2, V/V）、氯仿-甲醇(2:0.2，V/V)、环己烷-乙酸乙酯(1:2，V/V)、环己烷-乙酸乙酯 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
(1:5，V/V),等，通过TLC进行鉴定，结果如下图1（展开剂次序如上）：
图1 不同展开剂对同一组份TLC的影响
总浸膏用80g硅胶H干法拌样后上装有300g硅胶H的常压柱（如图2），用洗脱剂为石油醚-丙酮（75:1，V/V）到（5:1，V/V）的比例依次梯度洗脱分离，洗脱的组分减压浓缩后，以石油醚-丙酮（5:1，V/V）为展开剂，经TLC检测后，把相同的点合并，得到4个组分(Fraction，简写Fr)：Fr.A～Fr.D。分别在石油醚-丙酮（75:1，V/V）到（50:1，V/V）的比例洗脱中得到Fr.A，石油醚-丙酮（40:1，V/V）到（20:1，V/V）的比例洗脱中得到Fr.B，石油醚-丙酮（20:1，V/V）到（10:1，V/V）的比例洗脱中得到Fr.C，石油醚-丙酮（5:1，V/V）的比例洗脱中得到Fr.D，我所需要的红点在Fr.D内，然而红点洗脱下来时仍有较多杂质。由于分离的不是很理想，于是用原来的样品重新上减压柱（如图3），用洗脱剂为石油醚-丙酮（100:1，V/V）到（10:1，V/V）的比例依次梯度洗脱，展开剂为石油醚-丙酮（1:2，V/V）的TLC检测后合并得到组分：Fr.1～Fr.4，分别在石油醚-丙酮（100:1，V/V）到（40:1，V/V）得到Fr.1，石油醚-丙酮（30:1，V/V）到（20:1，V/V）得到Fr.2，石油醚-丙酮（10:1，V/V）得到Fr.3和Fr.4，经过展开剂为甲醇-水（5:1，V/V）TLC反向板，和展开剂为石油醚-丙酮（1:4，V/V）的TLC正向板验证，确定我所需要的红点在组分Fr.3内，但依然有少量杂质，遂将组分Fr.3经过Sephadex LH-20（如图4）纯化，氯仿-甲醇(1:1，V/V)洗脱得到组分Fr.3-1，经展开剂为氯仿-甲醇(2:0.1，V/V)的TLC检测，得到纯净的红点（如图5），即为化合物1，将其吹干并抽干等处理后，经1H NMR谱、13H NMR谱和质谱图解析。
摘要：大量研究表明，植物内生真菌能够产生结构新颖、活性多样的次级代谢产物，在医药、食品、农业等领域有广泛的应用，已经成为寻找和发现新化合物的宝贵资源。本研究利用极性及分子量的差异，对一株海芦笋内生真菌橘青霉（Penicillium citrinum）发酵产物中的化合物进行分离和鉴定。利用常压硅胶柱层析、减压硅胶柱层析、sephedex LH-20等分离方法从中分离得到1个单体化合物，通过电喷雾质谱（Electronic Spray Ion– Mass Spectrum）和核磁共振波谱（Nuclear magnetic resonance spectroscopy， NMR）包括1H NMR和13C NMR以及与参考文献数据对比，确定该化合物的化学结构为橘霉素，并对橘霉素的理化性质、来源、毒性、食品中的污染情况、限定标准和检测方法进行了分析和讨论。
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关键字:海芦笋；真菌；分离；橘霉素
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1.1 材料、试剂与仪器 2
1.2 提取分离 3
1.3 流程图 5
2 结果与分析 6
2.1 化合物结构解析 6
2.2 橘霉素 8
2.1.1 橘霉素的抑菌性 8
2.2.2 橘霉素的毒性 8
3 讨论 9
3.1 橘霉素的检测方法 9
3.1.1 高效液相色谱法 10
3.1.2 酶联免疫吸附法 10
3.1.3 薄层层析法 10
3.1.4 高效液相色谱-质谱分析法 11
致谢 11
参考文献 11
1株海芦笋内生真菌发酵产物化学成分初步研究
引言
海芦笋(Salicornia herbacea)学名盐角草，俗称海蓬子或海豆，它是一种鲜美多汁、口感咸脆的绿色时令海水蔬菜。其抗盐能力极高，超过海水盐度的20%～40%，内茎的可溶性盐分含量达37%。海芦笋富含多种活性物质，如胡萝卜素、槲皮素、异鼠、李素芸香苷等[1]。除此之外，海芦笋嫩茎中还含有天然植物盐和植物碱(微角皂甙)，食用后对人体有很多益处：可以中和人体血液中的脂肪酸，清除血管壁上的胆固醇[2]，降低血压，促进肝脏的新陈代谢，提高人体免疫力，还能够预防帕金森病。海芦笋中的提取物具有显著的体外抗氧化活性，与α-生育酚相当。
真菌在自然界中广泛存在，在长期的进化过程中，一些真菌寻找到一个理想的生活环境——植物体，它们进入植 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
物体，并且和谐地与植物生活在一起,成为植物体微生态系统的组成部分[3]。它们生活在植物的根、茎、叶等器官的组织内部，但一般不引起植物体病害，这些真菌我们称之为内生真菌(endophytic fungus)。通过对植物组织进行严格表面消毒，杀死其表面微生物并无菌操作取其内部组织在营养培养基上进行培养，一般可分离、纯化得到它们[4]。
对植物内生真菌研究发现，其次生代谢产物十分丰富，有萜类、生物碱、黄酮、和多炔类等化合物；研究表明植物内生真菌可以产生或促进宿主植物产生某些植物激素，张集慧等研究证明金线莲、墨兰、铁皮石斛、天麻等兰科植物内生真菌能够产生赤霉素、吲哚乙酸、脱落酸、玉米素、玉米素核苷等植物生长调节剂，袁志林等研究发现大戟科植物内生真菌B3分泌吲哚乙酸和脱落酸[5]。禾本科植物内生真菌能够产生多种生物碱，如有机胺类、吡喏里西啶类、麦角碱类等。Ju等从内生真菌感染的一种草熟禾中分离到数个对蚊子幼虫有毒性的黄酮类化合物。顾爱国等从苦皮藤内生真菌中分离到环肽类抗生素eniatinns类化合物，其对番茄早疫病菌、烟草赤星病菌、小麦根腐病菌、玉米大斑病菌4种植物病原真菌菌丝生长和孢子萌发抑制率均大于80%[6]。一些内生真菌能产生细胞壁分解酶，用以克服宿主防御异物的天然屏障，还能产生果胶酶、纤维素酶、酯酶等胞外酶。有些酶具有较高的商业应用价值。以上的种种实例足以说明内生真菌代谢产物十分丰富。
本实验室近年来持续开展了从盐生植物共附生真菌中寻找抗特殊成分的研究。在进行菌株筛选中，从盐生海芦笋中分离到一株真菌橘青霉（Penicillium citrinum）。本研究对该真菌发酵后的发酵产物进行溶剂提取、常压硅胶柱层析、减压硅胶柱层析、sephedex LH-20等分离纯化等得到单体化合物，应用现代波谱学方法解析化合物的结构。
1 材料与方法
1.1 材料、试剂与仪器
真菌8A-2（橘青霉Penicillium citrinum)是从采自盐城大丰港的野生盐生海芦笋中分离得到的，并已经过菌种发酵。
Sephadex LH-20 瑞典Pharmacia公司；硅胶H(200～400目)青岛海洋化工厂产品。常规提取分离用甲醇、丙酮、乙酸乙酯、石油醚、氯仿、环己烷等均为工业用化学纯产品，重蒸后使用。
JNM-ECP600 型核磁共振仪 日本Jeol 公司；Mariner API-TOF 型质谱仪 美国应用生物系统公司；HN101-1A鼓风干燥HN101-1A鼓风干燥箱 上海苏进仪器设备厂监制箱 上海苏进仪器设备厂监制； EYELAN-N型旋转薄膜蒸发仪 日本Rikakikai有限公司。
1.2 提取分离
把20L菌种发酵液用细密的纱布过滤后得到发酵液和菌丝体，随后将发酵液减压浓缩至5L，再加入等体积（浓缩后的体积5L）的乙酸乙酯，先后萃取3次。合并乙酸乙酯提取液、减压浓缩至1L得到发酵液浓缩液，再将菌丝体用等量（与发酵液浓缩液等量为1L）的80%丙酮提取2次，减压浓缩无水后用等量的乙酸乙酯提取3次，合并提取液并减压浓缩至1L得到菌丝体浓缩液，合并发酵液和菌丝体浓缩液减压蒸干得到乙酸乙酯提取总浸膏(22g)，分别用展开剂为石油醚-丙酮（1:2, V/V）、氯仿-甲醇(2:0.2，V/V)、环己烷-乙酸乙酯(1:2，V/V)、环己烷-乙酸乙酯 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
(1:5，V/V),等，通过TLC进行鉴定，结果如下图1（展开剂次序如上）：
图1 不同展开剂对同一组份TLC的影响
总浸膏用80g硅胶H干法拌样后上装有300g硅胶H的常压柱（如图2），用洗脱剂为石油醚-丙酮（75:1，V/V）到（5:1，V/V）的比例依次梯度洗脱分离，洗脱的组分减压浓缩后，以石油醚-丙酮（5:1，V/V）为展开剂，经TLC检测后，把相同的点合并，得到4个组分(Fraction，简写Fr)：Fr.A～Fr.D。分别在石油醚-丙酮（75:1，V/V）到（50:1，V/V）的比例洗脱中得到Fr.A，石油醚-丙酮（40:1，V/V）到（20:1，V/V）的比例洗脱中得到Fr.B，石油醚-丙酮（20:1，V/V）到（10:1，V/V）的比例洗脱中得到Fr.C，石油醚-丙酮（5:1，V/V）的比例洗脱中得到Fr.D，我所需要的红点在Fr.D内，然而红点洗脱下来时仍有较多杂质。由于分离的不是很理想，于是用原来的样品重新上减压柱（如图3），用洗脱剂为石油醚-丙酮（100:1，V/V）到（10:1，V/V）的比例依次梯度洗脱，展开剂为石油醚-丙酮（1:2，V/V）的TLC检测后合并得到组分：Fr.1～Fr.4，分别在石油醚-丙酮（100:1，V/V）到（40:1，V/V）得到Fr.1，石油醚-丙酮（30:1，V/V）到（20:1，V/V）得到Fr.2，石油醚-丙酮（10:1，V/V）得到Fr.3和Fr.4，经过展开剂为甲醇-水（5:1，V/V）TLC反向板，和展开剂为石油醚-丙酮（1:4，V/V）的TLC正向板验证，确定我所需要的红点在组分Fr.3内，但依然有少量杂质，遂将组分Fr.3经过Sephadex LH-20（如图4）纯化，氯仿-甲醇(1:1，V/V)洗脱得到组分Fr.3-1，经展开剂为氯仿-甲醇(2:0.1，V/V)的TLC检测，得到纯净的红点（如图5），即为化合物1，将其吹干并抽干等处理后，经1H NMR谱、13H NMR谱和质谱图解析。
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