血浆及白细胞n连接寡糖结构研究
食源性疾病是当前世界上最突出的卫生问题，其发病率居各类疾病发病率的前列。致病因子通过饮食进入人体后会引起机体各种生理或病理性改变如慢性炎症反应，从而导致人体体液免疫和细胞免疫发生相应变化，与此同时血液中血浆或白细胞上糖蛋白结合糖链也会产生变化，成为发现疾病和追踪疾病进程的指征。本实验对血液样本中N-糖链分析流程的多个方面进行了优化，包括样本前处理方法、糖链标记时间以及液相检测条件。并对优化后的糖链分析方法从灵敏度、稳定性、日间重复性以及普适性进行了验证。最后运用该方法，结合外切糖苷酶联合UPLC检测与MALDI-TOF质谱分析对血浆中N-糖链的结构进行分析确证。最终建立了适用于血浆及白细胞样品中N-连接寡糖结构分析平台。?
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1.材料与方法 2
1.1实验材料 2
1.1.1 原料 2
1.1.2 主要试剂 2
1.1.3 主要实验仪器 3
1.2方法描述 3
1.2.1样品收集 3
1.2.1.1样品制备 3
1.2.2 实验方法确定 3
1.2.2.1样品的前处理和PNGase F酶切消化 3
1.2.2.2 样品的纯化 4
1.2.2.3 样品的荧光标记 4
1.2.2.4 高效液相色谱检测 4
1.2.2.5 外切糖苷酶处理 5
1.2.2.6基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDITOFMS）分析 6
2.结果及分析 7
2.1 N连接寡糖处理方法的探究 7
2.1.1 血浆样品处理方法对色谱结果的影响测定 7
2.1.2 不同标记时间对色谱结果的影响测定 8
2.1.3 不同乙腈浓度的样品对色谱结果的影响测得 8
2.1.4 样品处理方法最低检测线（灵敏度）的测定 10
2.1.5 样品处理方法可重复性的验证 10
2.1.6 样品处理方法普适性的验证 11
2 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
.2 N连接寡糖结构的确定 13
2.2.1 GU值（Glucose Unit）的确定 13
2.2.2 各色谱峰结构的预筛选 13
2.2.3 MALDITOF质谱结果 15
2.2.3.1 正离子模式的分析结果 15
2.2.3.2 负离子模式的分析结果 24
2.2.4 N连接寡糖结构的结果 31
3.总结与讨论 33
致谢 35
参考文献 36
血浆及白细胞N连接寡糖结构研究
引言
引言：当今世界上最广泛的卫生问题之一便是由食品引起的疾病。据报告，食源性疾患（foodborne diseases）的发病率居各类疾病总发病率的第二位。食源性疾病也是现今世界的一个持续性问题。据世界卫生组织（WHO）和世界农粮组织（FAO）报告，早在上个世纪八十年代，亚洲、拉丁美洲和非洲平均每年有十亿多5岁以下的儿童患有急性腹泻病，至少有500万儿童因此而死亡。英国有1/5以上的肠道传染病是经过食物传播的[1]。美国食源性疾病每年平均爆发量在300起以上。即使到了医学高速发展的今天，食源性疾病依然是食品行业乃至全社会关注最多，也是最头痛的问题之一。因此，寻求更好的检测方法势在必行，具有重要意义。
人体的免疫系统主要有两种：即体液免疫和细胞免疫。与免疫相关的血液中所含的免疫调节因子、细胞因子、抗体等都是糖蛋白。除此之外，白细胞膜上的各种受体以及与膜结合蛋白也都是糖蛋白，这些糖蛋白上糖链均可能受病程的影响。譬如糖尿病、高血脂等疾病的血液糖蛋白指标就明显异于常人，其合成率虽然主要受血浆中血糖水平调节，但也受到食物中蛋白质含量的影响[2]。N连接寡糖是生物体内最为复杂的也是最为常见修饰方式，其在蛋白合成、折叠、运输的整个过程中都有极其重要的生理功能。以往的研究表明，N连接寡糖结构和含量的改变与疾病（例如炎症反应和癌症等）密切相关。因此，寡糖尤其是血液相关寡糖结构的变化能够作为临床诊断标志物。通过监测人体内血浆和白细胞N连接寡糖结构的变化来对食源性疾病进行检测及预防，是一个重要的研究方向。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 原料
用含有EDTA的真空负压管抽取A、B、O、AB四种不同血型的新鲜人血。
1.1.2 主要试剂
甲醇：广东光华科技股份有限公司
三氯乙酸：广东光华科技股份有限公司
氯仿：广东光华科技股份有限公司
甲酸（色谱纯）：德国默克两合有限公司
乙腈（色谱纯）：德国默克两合有限公司
氨水（色谱纯）：德国默克两合有限公司
DHB（2,5二羟基苯甲酸）：美国西格玛公司
2AB（2氨基苯甲酸胺）：广州金华大化学试剂有限公司
SupelcleanTM ENVICarbTM预装碳柱：美国西格玛公司
N糖苷酶F（PNGase F）：实验室自制
红细胞裂解液：北京索莱宝科技有限公司
1.1.3 主要实验仪器
高速冷冻离心机HemaTGL.16R：珠海黑马医学仪器有限公司
隔水式恒温培养箱GRP1960型：上海森信实验仪器有限公司
真空离心浓缩干燥机：太仓市华利达实验设备有限公司
超低温保存冰箱：中国海尔集团
制冰机：雪科电器有限公司
FA2004分析电子天平：上海良平仪器仪表有限公司
Shimadzu Nexera超高压液相色谱仪（配有LC30AD泵、RF20Axs荧光检测器SIL30AC自动进样器、LCsolution工作站）
基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱仪（MALDITOFMS）及其数据处理软件Bruker Flexanalysis 3.3，德国Bruker公司产品。
1.2 方法描述
1.2.1样品收集
1.2.1.1样品制备
（1）血浆样品：将采集好的新鲜血液用移液枪转移到2ml离心管中，用高速冷冻离心机以500g离心力离心15min，取上清液。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1.材料与方法 2
1.1实验材料 2
1.1.1 原料 2
1.1.2 主要试剂 2
1.1.3 主要实验仪器 3
1.2方法描述 3
1.2.1样品收集 3
1.2.1.1样品制备 3
1.2.2 实验方法确定 3
1.2.2.1样品的前处理和PNGase F酶切消化 3
1.2.2.2 样品的纯化 4
1.2.2.3 样品的荧光标记 4
1.2.2.4 高效液相色谱检测 4
1.2.2.5 外切糖苷酶处理 5
1.2.2.6基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDITOFMS）分析 6
2.结果及分析 7
2.1 N连接寡糖处理方法的探究 7
2.1.1 血浆样品处理方法对色谱结果的影响测定 7
2.1.2 不同标记时间对色谱结果的影响测定 8
2.1.3 不同乙腈浓度的样品对色谱结果的影响测得 8
2.1.4 样品处理方法最低检测线（灵敏度）的测定 10
2.1.5 样品处理方法可重复性的验证 10
2.1.6 样品处理方法普适性的验证 11
2 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
.2 N连接寡糖结构的确定 13
2.2.1 GU值（Glucose Unit）的确定 13
2.2.2 各色谱峰结构的预筛选 13
2.2.3 MALDITOF质谱结果 15
2.2.3.1 正离子模式的分析结果 15
2.2.3.2 负离子模式的分析结果 24
2.2.4 N连接寡糖结构的结果 31
3.总结与讨论 33
致谢 35
参考文献 36
血浆及白细胞N连接寡糖结构研究
引言
引言：当今世界上最广泛的卫生问题之一便是由食品引起的疾病。据报告，食源性疾患（foodborne diseases）的发病率居各类疾病总发病率的第二位。食源性疾病也是现今世界的一个持续性问题。据世界卫生组织（WHO）和世界农粮组织（FAO）报告，早在上个世纪八十年代，亚洲、拉丁美洲和非洲平均每年有十亿多5岁以下的儿童患有急性腹泻病，至少有500万儿童因此而死亡。英国有1/5以上的肠道传染病是经过食物传播的[1]。美国食源性疾病每年平均爆发量在300起以上。即使到了医学高速发展的今天，食源性疾病依然是食品行业乃至全社会关注最多，也是最头痛的问题之一。因此，寻求更好的检测方法势在必行，具有重要意义。
人体的免疫系统主要有两种：即体液免疫和细胞免疫。与免疫相关的血液中所含的免疫调节因子、细胞因子、抗体等都是糖蛋白。除此之外，白细胞膜上的各种受体以及与膜结合蛋白也都是糖蛋白，这些糖蛋白上糖链均可能受病程的影响。譬如糖尿病、高血脂等疾病的血液糖蛋白指标就明显异于常人，其合成率虽然主要受血浆中血糖水平调节，但也受到食物中蛋白质含量的影响[2]。N连接寡糖是生物体内最为复杂的也是最为常见修饰方式，其在蛋白合成、折叠、运输的整个过程中都有极其重要的生理功能。以往的研究表明，N连接寡糖结构和含量的改变与疾病（例如炎症反应和癌症等）密切相关。因此，寡糖尤其是血液相关寡糖结构的变化能够作为临床诊断标志物。通过监测人体内血浆和白细胞N连接寡糖结构的变化来对食源性疾病进行检测及预防，是一个重要的研究方向。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 原料
用含有EDTA的真空负压管抽取A、B、O、AB四种不同血型的新鲜人血。
1.1.2 主要试剂
甲醇：广东光华科技股份有限公司
三氯乙酸：广东光华科技股份有限公司
氯仿：广东光华科技股份有限公司
甲酸（色谱纯）：德国默克两合有限公司
乙腈（色谱纯）：德国默克两合有限公司
氨水（色谱纯）：德国默克两合有限公司
DHB（2,5二羟基苯甲酸）：美国西格玛公司
2AB（2氨基苯甲酸胺）：广州金华大化学试剂有限公司
SupelcleanTM ENVICarbTM预装碳柱：美国西格玛公司
N糖苷酶F（PNGase F）：实验室自制
红细胞裂解液：北京索莱宝科技有限公司
1.1.3 主要实验仪器
高速冷冻离心机HemaTGL.16R：珠海黑马医学仪器有限公司
隔水式恒温培养箱GRP1960型：上海森信实验仪器有限公司
真空离心浓缩干燥机：太仓市华利达实验设备有限公司
超低温保存冰箱：中国海尔集团
制冰机：雪科电器有限公司
FA2004分析电子天平：上海良平仪器仪表有限公司
Shimadzu Nexera超高压液相色谱仪（配有LC30AD泵、RF20Axs荧光检测器SIL30AC自动进样器、LCsolution工作站）
基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱仪（MALDITOFMS）及其数据处理软件Bruker Flexanalysis 3.3，德国Bruker公司产品。
1.2 方法描述
1.2.1样品收集
1.2.1.1样品制备
（1）血浆样品：将采集好的新鲜血液用移液枪转移到2ml离心管中，用高速冷冻离心机以500g离心力离心15min，取上清液。
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