角蛋白降解菌高产二硫键还原酶的发酵条件条件优化
角蛋白肽链间存在大量二硫键、疏水基团和氢键，因而构造稳定且不易被破坏。降解角蛋白的关键是打开蛋白内部的二硫键，破坏其空间结构。相对于物理和化学方法，微生物降解角蛋白的方法条件温和而且无污染、氨基酸破坏小。本实验在前人研究高产二硫键还原酶的菌种的基础上，对降解角蛋白的机制以及发酵条件进行研究，改变温度、pH、碳源、氮源四个单因素发酵测定其二硫键还原酶活性从而达到优化发酵条件的目的，为角蛋白高效降解羽毛提供指导。本实验选用前人筛选出Pseudomonas aeruginosa作为研究菌体。菌种活化后，对比不同的羽毛粉发酵情况选出发酵效果较好的手工羽毛粉，接种发酵制备酶液，检测发现菌胞内液二硫键活性较高，胞内二硫键还原酶可能是破坏二硫键从而促进角蛋白降解的机制之一。通过进行亚硫酸盐和硫代硫酸盐检测，得出硫代硫酸盐检测呈阴性，发酵过程中有亚硫酸盐产生。通过改变不同发酵因素，检测胞内二硫键还原酶活性，得出最优发酵条件起始pH7.5，温度30℃，接种量4%，转速200 rpm，发酵48 h。加入1%的葡萄糖可以显著提高酶活。发酵条件优化后角蛋白降解菌高产二硫键还原酶活性高、稳定性好、特性优良，为高效生物降解提供支持，对角蛋白降解菌高产二硫键还原酶的发酵条件优化研究具有重要的理论和实际意义。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
绪论2
1材料与设备3
1.1试验菌株 3
1.2培养基3
1.3主要仪器3
2试验方法3
2.1菌株的活化 3
2.2羽毛粉的选择3
2.3酶液的制备及菌株胞内、胞外酶活性分析3
2.4二硫键还原酶活性测定3
2.5亚硫酸盐及硫代硫酸盐检测4
2.6pH对二硫键还原酶的影响4
2.7温度对二硫键还原酶的影响4
2.8氮源对二硫键还原酶的影响4
2.9碳源对二硫键还原酶的影响4
2.10初始发酵条件和优化后发酵条件对比4
3结果与分析5
3.1羽毛粉种类对比结果5
3.2发酵过程pH与生物量变化及菌株 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
胞内、胞外酶活性分析结果5
3.3亚硫酸盐和硫代硫酸盐检测6
3.4最适发酵pH7
3.5最适发酵温度7
3.6氮源对发酵影响8
3.7碳源对发酵影响8
3.8发酵条件优化前后对比9
4小结9
致谢10
参考文献10
角蛋白降解菌高产二硫键还原酶的发酵条件优化
引言
绪论
我国一直以来就是饲料生产的大国，也是畜禽养殖大国。在养殖过程中，产生大量的屠宰废弃物，其中羽毛是一种可以经多种处理、加工后再利用的天然蛋白质资源，蛋白质约占85%，具有很大意义的潜在价值，因此角蛋白资源的开发利用迫在眉睫。
但是在角蛋白资源的利用中面临着一个难题，角蛋白中含有较多的胱氨酸，他们之间形成大量的二硫键，再加上氢键和分子间作用力，普通蛋白酶并不能将其降解。我国年产家禽羽毛约70万t，除少部分作为保暖填充材料，大部分被废弃而未得到充分利用，这一现状在浪费大量动物蛋白资源的同时，也会造成环境污染[1]。
角蛋白酶改变了对角蛋白的传统处理方式，在对于废弃羽毛的处理上能发挥很好的作用[2]。在生物医用材料领域，角蛋白酶可以对羊毛、羽毛等天然高分子蛋白进行加工，生产出具有良好的亲和性和生物相容性的高分子材料，如将羊毛通过角蛋白酶处理后，再与其他高分子材料共混进行医用材料的制备。由于角蛋白酶对底物具有较强的选择性，可以在动物胶原蛋白生产中使用，用于非胶原蛋白成分的脱除，这对生产高含量、高品质的胶原蛋白有突出的利用价值。角蛋白酶还可将来源特殊的一些角蛋白降解为小分子短肽或氨基酸，开发具有抗氧化、抗菌、增加免疫、降压等作用的功能多肽[3]。角蛋白酶广泛应用于医药、化工、饲料、纺织和制革等工业中，在用于免疫制剂的制备、洗涤剂、日化产品生产和皮革软化等方面有广泛的应用价值。
影响角蛋白酶活性和稳定性的因素很多，主要有温度、pH、各种离子、抑制剂和激活剂等[3]。温度对于角蛋白酶的活性影响较大，温度过高或者过低都会使其失活。角蛋白酶的一般活性温度在30℃~60℃之间。也有一些在高温下同样具有较高活性的角蛋白酶，如耐盐嗜碱芽孢杆菌PPKS2分泌的角蛋白酶在60~70℃保持了较好的活性，而铜绿假单胞菌KS1分泌的耐热角蛋白酶在80℃下仍有很高的角蛋白酶活性。另外，由于角蛋白酶的自身溶解性，温度还对角蛋白酶的稳定性有很大影响，B. licheniformis PWD1的角蛋白酶在室温25℃下，4d时活性下降50%，低温4℃和20℃保存19 d后，活性分别丧失20%和7%。
羽毛主要由角蛋白（91%）组成，其表面角质层主要由高级脂肪酸和高级脂肪醇等脂类物质形成的动物蜡组成（1%）[45]。底层蛋白分子与这些脂质共价结合，疏水基外露，呈现出极强的疏水性。而与其他蛋白纤维相比，角蛋白半胱氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸和丝氨酸含量高，角蛋白中半胱氨酸之间形成二硫键，从而使角蛋白的结构更稳定[5]，常见蛋白酶并不能将其彻底水解。然而，二硫键还原可显著影响角蛋白的降解，因此打开二硫键可能是水解角蛋白的关键步骤之一。
本课题选用前人筛选的Pseudomonas aeruginosa，探讨角蛋白降解机制，并对发酵的条件进行优化，使得角蛋白降解菌高产二硫键还原酶活性高、稳定性好、特性优良，为高效生物降解提供支持。因此，对角蛋白降解菌高产二硫键还原酶的发酵条件优化研究具有重要的理论和实际意义。
1 材料与设备
1．1 试验菌株
Pseudomonas aeruginosa 绿脓杆菌：实验室分离纯化保存于80℃。
1．2培养基
基础培养基：NaCl 0.0075 g，K2HPO4 0.015 g，KH2PO4 0.006 g，蒸馏水15 mL，pH 7.47.6，121℃灭菌20 min。
种子培养基：牛肉膏0.25 g，蛋白胨0.5 g，NaCl 0.025 g，K2HPO4 0.05 g，KH2PO4 0.02 g，蒸馏水50 mL，pH7.47.6，121℃灭菌20 min。
发酵培养基：羽毛粉0.15 g，NaCl 0.0075 g，K2HPO4 0.015 g，KH2PO4 0.006 g，蒸馏水15 mL，pH 7.47.6，121℃灭菌20 min。
1．3主要仪器
TS1102C恒温摇床、HWS24电热恒温水浴锅、Cary 100bio紫外/可见分光光度计、TGL20M台式高速冷冻离心机、DLCTINDⅡ洁净工作台
2试验方法
2．1菌株的活化
接种保藏的菌种至15 mL种子液中，振荡培养12h左右，再次接种至15 mL种子液中，振荡培养23h，检测OD600，若0.6< OD600<0.8即为对数期的种子液。培养条件：接种量4%、温度37℃、转速200 rpm。
2．2羽毛粉的选择
选用手工羽毛粉和工厂羽毛粉为底物的发酵液接种后进行发酵48 h，提取上清液测定二硫键还原酶活性，确定选用羽毛粉的种类。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
绪论2
1材料与设备3
1.1试验菌株 3
1.2培养基3
1.3主要仪器3
2试验方法3
2.1菌株的活化 3
2.2羽毛粉的选择3
2.3酶液的制备及菌株胞内、胞外酶活性分析3
2.4二硫键还原酶活性测定3
2.5亚硫酸盐及硫代硫酸盐检测4
2.6pH对二硫键还原酶的影响4
2.7温度对二硫键还原酶的影响4
2.8氮源对二硫键还原酶的影响4
2.9碳源对二硫键还原酶的影响4
2.10初始发酵条件和优化后发酵条件对比4
3结果与分析5
3.1羽毛粉种类对比结果5
3.2发酵过程pH与生物量变化及菌株 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
胞内、胞外酶活性分析结果5
3.3亚硫酸盐和硫代硫酸盐检测6
3.4最适发酵pH7
3.5最适发酵温度7
3.6氮源对发酵影响8
3.7碳源对发酵影响8
3.8发酵条件优化前后对比9
4小结9
致谢10
参考文献10
角蛋白降解菌高产二硫键还原酶的发酵条件优化
引言
绪论
我国一直以来就是饲料生产的大国，也是畜禽养殖大国。在养殖过程中，产生大量的屠宰废弃物，其中羽毛是一种可以经多种处理、加工后再利用的天然蛋白质资源，蛋白质约占85%，具有很大意义的潜在价值，因此角蛋白资源的开发利用迫在眉睫。
但是在角蛋白资源的利用中面临着一个难题，角蛋白中含有较多的胱氨酸，他们之间形成大量的二硫键，再加上氢键和分子间作用力，普通蛋白酶并不能将其降解。我国年产家禽羽毛约70万t，除少部分作为保暖填充材料，大部分被废弃而未得到充分利用，这一现状在浪费大量动物蛋白资源的同时，也会造成环境污染[1]。
角蛋白酶改变了对角蛋白的传统处理方式，在对于废弃羽毛的处理上能发挥很好的作用[2]。在生物医用材料领域，角蛋白酶可以对羊毛、羽毛等天然高分子蛋白进行加工，生产出具有良好的亲和性和生物相容性的高分子材料，如将羊毛通过角蛋白酶处理后，再与其他高分子材料共混进行医用材料的制备。由于角蛋白酶对底物具有较强的选择性，可以在动物胶原蛋白生产中使用，用于非胶原蛋白成分的脱除，这对生产高含量、高品质的胶原蛋白有突出的利用价值。角蛋白酶还可将来源特殊的一些角蛋白降解为小分子短肽或氨基酸，开发具有抗氧化、抗菌、增加免疫、降压等作用的功能多肽[3]。角蛋白酶广泛应用于医药、化工、饲料、纺织和制革等工业中，在用于免疫制剂的制备、洗涤剂、日化产品生产和皮革软化等方面有广泛的应用价值。
影响角蛋白酶活性和稳定性的因素很多，主要有温度、pH、各种离子、抑制剂和激活剂等[3]。温度对于角蛋白酶的活性影响较大，温度过高或者过低都会使其失活。角蛋白酶的一般活性温度在30℃~60℃之间。也有一些在高温下同样具有较高活性的角蛋白酶，如耐盐嗜碱芽孢杆菌PPKS2分泌的角蛋白酶在60~70℃保持了较好的活性，而铜绿假单胞菌KS1分泌的耐热角蛋白酶在80℃下仍有很高的角蛋白酶活性。另外，由于角蛋白酶的自身溶解性，温度还对角蛋白酶的稳定性有很大影响，B. licheniformis PWD1的角蛋白酶在室温25℃下，4d时活性下降50%，低温4℃和20℃保存19 d后，活性分别丧失20%和7%。
羽毛主要由角蛋白（91%）组成，其表面角质层主要由高级脂肪酸和高级脂肪醇等脂类物质形成的动物蜡组成（1%）[45]。底层蛋白分子与这些脂质共价结合，疏水基外露，呈现出极强的疏水性。而与其他蛋白纤维相比，角蛋白半胱氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸和丝氨酸含量高，角蛋白中半胱氨酸之间形成二硫键，从而使角蛋白的结构更稳定[5]，常见蛋白酶并不能将其彻底水解。然而，二硫键还原可显著影响角蛋白的降解，因此打开二硫键可能是水解角蛋白的关键步骤之一。
本课题选用前人筛选的Pseudomonas aeruginosa，探讨角蛋白降解机制，并对发酵的条件进行优化，使得角蛋白降解菌高产二硫键还原酶活性高、稳定性好、特性优良，为高效生物降解提供支持。因此，对角蛋白降解菌高产二硫键还原酶的发酵条件优化研究具有重要的理论和实际意义。
1 材料与设备
1．1 试验菌株
Pseudomonas aeruginosa 绿脓杆菌：实验室分离纯化保存于80℃。
1．2培养基
基础培养基：NaCl 0.0075 g，K2HPO4 0.015 g，KH2PO4 0.006 g，蒸馏水15 mL，pH 7.47.6，121℃灭菌20 min。
种子培养基：牛肉膏0.25 g，蛋白胨0.5 g，NaCl 0.025 g，K2HPO4 0.05 g，KH2PO4 0.02 g，蒸馏水50 mL，pH7.47.6，121℃灭菌20 min。
发酵培养基：羽毛粉0.15 g，NaCl 0.0075 g，K2HPO4 0.015 g，KH2PO4 0.006 g，蒸馏水15 mL，pH 7.47.6，121℃灭菌20 min。
1．3主要仪器
TS1102C恒温摇床、HWS24电热恒温水浴锅、Cary 100bio紫外/可见分光光度计、TGL20M台式高速冷冻离心机、DLCTINDⅡ洁净工作台
2试验方法
2．1菌株的活化
接种保藏的菌种至15 mL种子液中，振荡培养12h左右，再次接种至15 mL种子液中，振荡培养23h，检测OD600，若0.6< OD600<0.8即为对数期的种子液。培养条件：接种量4%、温度37℃、转速200 rpm。
2．2羽毛粉的选择
选用手工羽毛粉和工厂羽毛粉为底物的发酵液接种后进行发酵48 h，提取上清液测定二硫键还原酶活性，确定选用羽毛粉的种类。
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