肉源性腐败菌生物菌膜形成及其胞外分泌物研究
摘要：在肉品加工过程中，肉源性腐败菌生物菌膜会给产品带来极大的污染隐患，研究表明，食品加工器械表面存在的粘附菌体是引起食品交叉污染的重要原因。本研究设计了高浓度短期粘附和低浓度长期粘附两方面试验，并通过低浓度长期粘附试验得出，不同菌株的生物菌膜形成能力存在显著差异。在8种常见肉源性腐败菌中，费氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)和杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)(Ⅱ)的初始粘附能力最强，但生物菌膜形成能力较弱；荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescent)和阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)形成生物菌膜的能力最强。通过高浓度短期粘附得出，荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescent)和杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)(Ⅰ)的初始粘附数量最高，但杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)(Ⅱ)和费氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)的粘附增长趋势最明显，粘附增长量最大。本研究还通过全反射傅里叶变换红外光谱(ATR-FTIR)分析胞外分泌物(EPS)组分，发现浮游菌体与生物菌膜存在明显差异，浮游菌体中几乎不含胞外分泌物，而生物菌膜胞外分泌物中含有蛋白质、多糖、脂肪酸、磷酸盐复合物及DNA。在8株肉源性腐败菌中，阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)和荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescent)的EPS组分最为丰富且蛋白及多糖类物质含量显著高于其他菌株。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1. 1 试验材料 2
1. 2 试剂与仪器 2
1.2.1 主要试剂 2
1.2.2 主要仪器设备 2
1. 3 技术路线 3
1. 4 试验方法 3
1.4.1 高浓度短期粘附试验 3
1.4.2 低浓度长期粘附试验 3
1.4.3 ATRFTIR对胞外分泌物的测定 4
1.4
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
.4 统计分析 4
2 结果与分析 4
2．1 高浓度短期粘附试验 4
2．2 低浓度长期粘附试验 5
2. 3 ATRFTIR对胞外分泌物的测定 6
3 讨论 9
3．1 8种肉源性腐败菌粘附能力及生物菌膜的形成 9
3．2 生物菌膜胞外分泌物组分研究 10
致谢 11
参考文献 11
肉源性腐败菌生物菌膜形成及其胞外分泌物研究
引言
在肉品加工过程中，由于加工原料所富含的营养物质极为丰富，给微生物的生长繁殖创造了绝佳的条件，因此由微生物污染所引发的食品安全问题一直以来成为公众关注的焦点。在20062010年我国食源性疾病发病原因的统计结果中，因微生物病原菌导致的食源性疾病占所有成因的61.92%[1]。可见，微生物污染给食品安全带来的隐患不容小觑。与此同时，随着食品加工工业化进程的不断推进，食品加工器械的安全性也逐渐得到关注，食品加工设备由于长期与携带微生物的加工原料相接触，其表面极易存在大量的粘附菌体。这些可以增殖并粘附在食品加工设备表面，并可通过菌体与菌体、菌体与接触面之间的相互作用力，由菌体增殖及胞外分泌物连接所形成的具有一定三维结构的细菌聚集体，称为生物菌膜[23]。
由于生物菌膜胞外分泌物中存在多糖成分，因此其中的糖苷键能够使生物菌膜的机械强度增高、稳定性更强。除此之外，多糖复合物被膜能够将菌体包裹在其内部，导致抗菌物质无法进入菌体细胞，从而使微生物的抗性大大增强，因此，生物菌膜相比于浮游菌体，对外界不良环境的抵抗能力更强，对于大多数外源性食品类清洗剂和杀菌剂都具有更强的耐受能力。研究表明，即使通过标准化程序严格清洗消毒的食品加工设备表面，仍能够检测到大量生物菌膜[46]。基于目前研究现状，本研究以8种肉源性腐败菌为研究对象，以304食品级不锈钢片作为接触面，以TSB标准培养基为生长基质，对比8种肉源性腐败菌生物菌膜的生长情况，以及同种菌株生物菌膜分别在高浓度短期培养和低浓度长期培养实验下的不同粘附情况。另外本研究还通过全反射傅里叶变换红外光谱(ATRFTIR)对8种肉源性腐败菌生物菌膜胞外分泌物的组分进行分析，并探究生物菌膜胞外分泌物在培养时间内的数量变化，为研究具有分散胞外分泌物作用的杀菌剂和清洗剂提供参考，并为肉品加工过程中的安全控制提供保障。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
本研究中使用的试验菌种全部为国家肉品质量安全控制工程技术研究中心保藏菌种，其中费氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、奇异变形杆菌(?Proteus?mirabilis)、产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)分离株分离自腐败烧鸡；蜂窝哈夫尼菌(G)(Hafnia alvei)、杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)(Ⅰ)分离株分离自腐败冰鲜鸡胸肉；阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescent)、杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)(Ⅱ)分离株分离自黄羽肉鸡胴体。杀鲑气单胞菌(Ⅰ)的蛋白分解圈小，杀鲑气单胞菌(Ⅱ)的蛋白分解圈大。
1. 2 试剂与仪器
1.2.1 主要试剂
胰酪胨大豆琼脂(TSA，Tryptose Soya Ager)、胰蛋白胨大豆肉汤(TSB，Trypticace Soy Broth)购于青岛高科园海博生物技术有限公司。
氯化钠购于南京化学试剂有限公司、无水乙醇购于国药集团化学试剂有限公司、
1.2.2 主要仪器设备
食品级304不锈钢表面(74×22×1mm，2B光洁面)
东莞中意不锈钢材料有限公司
SG403A Sterile GARD生物安全柜
美国BAKER公司
BagMixer 400VW 均质机
法国Interscience公司
Easy Spiral Pro 全自动螺旋接种仪
法国Interscience公司
Scan 1200自动影像分析菌落计数仪
法国Interscience公司
DHGIII 电热恒温鼓风干燥箱
上海新苗医疗器械制造有限公司
TGL16G高速台式离心机
湖南湘仪离心机仪器有限公司
NEXUS 670全反射傅里叶变换红外光谱仪
美国Thermo Nicolet公司
HZQF160A 高低温恒温振荡培养箱
上海悦丰仪器仪表有限公司
HZQF160A 高低温恒温振荡培养箱
上海悦丰仪器仪表有限公司
HVE50灭菌锅
日本HIRAYAMA公司
Lab dancer 微型涡旋混合仪
德国IKA公司
M2多功能酶标仪
美国Molecular Toledo公司
PL202L天平
瑞士Mettler Toledo公司
MilliQ超纯水系统
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1. 1 试验材料 2
1. 2 试剂与仪器 2
1.2.1 主要试剂 2
1.2.2 主要仪器设备 2
1. 3 技术路线 3
1. 4 试验方法 3
1.4.1 高浓度短期粘附试验 3
1.4.2 低浓度长期粘附试验 3
1.4.3 ATRFTIR对胞外分泌物的测定 4
1.4
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.4 统计分析 4
2 结果与分析 4
2．1 高浓度短期粘附试验 4
2．2 低浓度长期粘附试验 5
2. 3 ATRFTIR对胞外分泌物的测定 6
3 讨论 9
3．1 8种肉源性腐败菌粘附能力及生物菌膜的形成 9
3．2 生物菌膜胞外分泌物组分研究 10
致谢 11
参考文献 11
肉源性腐败菌生物菌膜形成及其胞外分泌物研究
引言
在肉品加工过程中，由于加工原料所富含的营养物质极为丰富，给微生物的生长繁殖创造了绝佳的条件，因此由微生物污染所引发的食品安全问题一直以来成为公众关注的焦点。在20062010年我国食源性疾病发病原因的统计结果中，因微生物病原菌导致的食源性疾病占所有成因的61.92%[1]。可见，微生物污染给食品安全带来的隐患不容小觑。与此同时，随着食品加工工业化进程的不断推进，食品加工器械的安全性也逐渐得到关注，食品加工设备由于长期与携带微生物的加工原料相接触，其表面极易存在大量的粘附菌体。这些可以增殖并粘附在食品加工设备表面，并可通过菌体与菌体、菌体与接触面之间的相互作用力，由菌体增殖及胞外分泌物连接所形成的具有一定三维结构的细菌聚集体，称为生物菌膜[23]。
由于生物菌膜胞外分泌物中存在多糖成分，因此其中的糖苷键能够使生物菌膜的机械强度增高、稳定性更强。除此之外，多糖复合物被膜能够将菌体包裹在其内部，导致抗菌物质无法进入菌体细胞，从而使微生物的抗性大大增强，因此，生物菌膜相比于浮游菌体，对外界不良环境的抵抗能力更强，对于大多数外源性食品类清洗剂和杀菌剂都具有更强的耐受能力。研究表明，即使通过标准化程序严格清洗消毒的食品加工设备表面，仍能够检测到大量生物菌膜[46]。基于目前研究现状，本研究以8种肉源性腐败菌为研究对象，以304食品级不锈钢片作为接触面，以TSB标准培养基为生长基质，对比8种肉源性腐败菌生物菌膜的生长情况，以及同种菌株生物菌膜分别在高浓度短期培养和低浓度长期培养实验下的不同粘附情况。另外本研究还通过全反射傅里叶变换红外光谱(ATRFTIR)对8种肉源性腐败菌生物菌膜胞外分泌物的组分进行分析，并探究生物菌膜胞外分泌物在培养时间内的数量变化，为研究具有分散胞外分泌物作用的杀菌剂和清洗剂提供参考，并为肉品加工过程中的安全控制提供保障。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
本研究中使用的试验菌种全部为国家肉品质量安全控制工程技术研究中心保藏菌种，其中费氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、奇异变形杆菌(?Proteus?mirabilis)、产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)分离株分离自腐败烧鸡；蜂窝哈夫尼菌(G)(Hafnia alvei)、杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)(Ⅰ)分离株分离自腐败冰鲜鸡胸肉；阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescent)、杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)(Ⅱ)分离株分离自黄羽肉鸡胴体。杀鲑气单胞菌(Ⅰ)的蛋白分解圈小，杀鲑气单胞菌(Ⅱ)的蛋白分解圈大。
1. 2 试剂与仪器
1.2.1 主要试剂
胰酪胨大豆琼脂(TSA，Tryptose Soya Ager)、胰蛋白胨大豆肉汤(TSB，Trypticace Soy Broth)购于青岛高科园海博生物技术有限公司。
氯化钠购于南京化学试剂有限公司、无水乙醇购于国药集团化学试剂有限公司、
1.2.2 主要仪器设备
食品级304不锈钢表面(74×22×1mm，2B光洁面)
东莞中意不锈钢材料有限公司
SG403A Sterile GARD生物安全柜
美国BAKER公司
BagMixer 400VW 均质机
法国Interscience公司
Easy Spiral Pro 全自动螺旋接种仪
法国Interscience公司
Scan 1200自动影像分析菌落计数仪
法国Interscience公司
DHGIII 电热恒温鼓风干燥箱
上海新苗医疗器械制造有限公司
TGL16G高速台式离心机
湖南湘仪离心机仪器有限公司
NEXUS 670全反射傅里叶变换红外光谱仪
美国Thermo Nicolet公司
HZQF160A 高低温恒温振荡培养箱
上海悦丰仪器仪表有限公司
HZQF160A 高低温恒温振荡培养箱
上海悦丰仪器仪表有限公司
HVE50灭菌锅
日本HIRAYAMA公司
Lab dancer 微型涡旋混合仪
德国IKA公司
M2多功能酶标仪
美国Molecular Toledo公司
PL202L天平
瑞士Mettler Toledo公司
MilliQ超纯水系统
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