林蛙油抗氧化多糖的分离纯化与结构表征【字数：8553】
摘 要林蛙油广泛分布于我国中北部，主要于我国的黑龙江、吉林等一带，尤其是吉林省居多。林蛙油被收录于《中国药典》,其具有补肾益精、养阴润肺等功效。本文通过探测林蛙油多糖的抗氧化活性及结构表征来确定所含多糖。以林蛙油为原材料，采用超声波辅助-胰酶的方法提取林蛙油多糖，并进一步采用Sevag法脱蛋白；粗多糖做抗氧化性试验；再过DEAE-52；采用苯酚硫酸法和GC、FT-IR检测林蛙油多糖含量以及单糖组成成分和结构表征。结果表明，林蛙油多糖的提取参数为原料过10目筛，料水比为1100，回流提取温度80℃，旋转蒸发浓缩温度65℃，醇沉至80%。林蛙油脱蛋白后多糖的含量58.2%,其抗氧化性活性较好,羟基自由基清除率试验,IC50为0.66mg/mL，DPPH清除试验IC50为0.78mg/mL，还原力试验IC50为0.51mg/mL，通过DEAE-52柱层析法，在0.2mol/L、0.4mol/LNacl下洗脱出两个峰，即为峰1峰2，峰1含有鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖和半乳糖，它们的摩尔比为2.21.81.06.82.5，峰2含有阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成的，它们的摩尔比为1.83.11.05.54.6。峰1的重均分子量为548619，峰2的重均分子量为366038，两种峰中含有相同的单糖组成成分葡萄糖和半乳糖。红外和二阶导数进一步通过官能团验证单糖组分，结果与单糖组分分析相一致。
Keywords: Rana oil; Polysaccharide; Antioxidant activity；Monosaccharide component 目 录
1．引言 1
1.1 林蛙油简介 1
1.2 动物多糖 1
1.3多糖常用提取分离方法 2
1.4 本实验研究目的及意义 2
2．材料与方法 3
2.1 实验材料 3
2.1.1 原料 3
2.1.2 试剂 3
2.1.3 主要仪器与设备 3
2.2实验方法 4
2.2.1多糖的标准曲线制作 4
2.2.2林蛙油多糖的提取 4
2.2.3多糖的鉴别 5
2.2.4林蛙油多糖的分离 5 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
2.2.5体外抗氧化试验 5
2.2.6林蛙油多糖的纯化 6
2.2.7 林蛙油多糖的结构表征 6
3． 结果与分析 8
3.1林蛙油多糖的判定 8
3.2 林蛙油多糖含量的测定 8
3.3 抗氧化活性的测定 8
3.3.1羟基自由基清除活性 8
3.3.2DPPH清除实验 9
3.3.3还原力实验 10
3.4 林蛙油洗脱曲线分析 11
3.5 林蛙油多糖的单糖组成分析 12
3.5.1红外光谱分析 12
3.5.2单糖组成分析 14
3.5.3分子量分析 15
4．结论 17
5．展望 18
参考文献 19
致谢 21
1．引言
1.1 林蛙油简介
林蛙油主要成分有：蛋白质71%、糖类13.7%、脂类2.6%。林蛙油富含不同种的多糖，多糖是由二十多个乃至上万个单糖组成的一类生物大分子，是由酮糖或醛糖之间通过糖苷键连接在一起而形成的多聚物。它是构成生命的基础物质。多糖具有开关、调谐、作为激素、胞内转运、保护、促进物质吸收、参与血液凝 固、参与细胞识别等多方面的重要生理活性。林蛙输卵管多糖的初步研究结果显示，输卵管组织中可溶性多糖含量极高，占输卵管蛋白质总量的 58.3% ～ 65.7% ,是提取动物多糖良品[3]。
1.2 动物多糖
随着对动物的研究，动物多糖被不断的提取，其是一类具有生物活性的多糖类物质，而且分布极其分布广泛，组织中几乎都有存在。动物多糖主要是存在于动物的细胞中细胞质中，但是又由于多糖的分布不是均一分布的，是根据组织类型进行分布[4]。例如动物多糖中的硫酸软骨素就是分布于骨架中；透明质酸在关节、脐带等地方含量较高，而肝素大多分泌在肝脏等肥大的器官组织中。
1.3多糖常用提取分离方法
多糖的分离方法也是很丰富的。像除蛋白中就有三氯乙酸法、sevage法、三氟三氯乙烷法、酶解法等。色素的去除则通过弱碱性树脂DEAE纤维素来吸附色素[7]，或者常用的吸附剂也可去除。最后将多糖进行纯化，可通过分部沉淀法、柱层析法，本文就采用了凝胶柱层析法来洗脱多糖。
1.4 本实验研究目的及意义
林蛙油是食源性保健食品，也是医疗保健品。林蛙油的研究最早来自于国外，亚洲的久保田精光(1934年），认为其主要成分为蛋白质。国内二十世纪八十年代开始研究林蛙油，自然风干的林蛙油，主要含有粗蛋白、粗脂肪、灰分、氨基酸等成分。之后王春霖、刘奇林等人证实林蛙油中还存在甾类物质、脂肪酸、微量元素等[7]。但对林蛙油的多糖成分研究非常少，林蛙油一些功效是否和其多糖类物质有关，目前尚不明确。因此，研究林蛙油多糖的提取条件、单糖组分以及它们的的结构特征具有重要的意义。
本文以林蛙油为材料，采用超声波胰酶辅助法提取多糖，并进一步采用Sevag脱蛋白；DEAE、葡聚糖凝胶分离单糖组分，应用GC、FTIR等设备分析单糖组分，并对其评价不同单体多糖对羟基自由基、DPPH自由基等的清除能力。
2．材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 原料
林蛙油，吉林长春。
2.1.2 试剂
石油醚
江苏强盛化工有限公司
胰酶
江苏强盛化工有限公司
乙醇
江苏强盛化工有限公司
正丁醇
江苏强盛化工有限公司
三氯甲烷
江苏强盛化工有限公司
浓硫酸
上海强顺化工有限公司
苯酚
上海强顺化工有限公司
浓盐酸
上海强顺化工有限公司
氢氧化钠
江苏强盛化工有限公司
氯化钠
江苏强盛化工有限公司
双氧水
江苏强盛化工有限公司
DPPH试剂
西安沃尔森生物技术有限公司
三氯乙酸（TCA）
天津市致远化学试剂有限公司
铁氰化钾
天津市致远化学试剂有限公司
三氯化铁
天津市致远化学试剂有限公司
Keywords: Rana oil; Polysaccharide; Antioxidant activity；Monosaccharide component 目 录
1．引言 1
1.1 林蛙油简介 1
1.2 动物多糖 1
1.3多糖常用提取分离方法 2
1.4 本实验研究目的及意义 2
2．材料与方法 3
2.1 实验材料 3
2.1.1 原料 3
2.1.2 试剂 3
2.1.3 主要仪器与设备 3
2.2实验方法 4
2.2.1多糖的标准曲线制作 4
2.2.2林蛙油多糖的提取 4
2.2.3多糖的鉴别 5
2.2.4林蛙油多糖的分离 5 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
2.2.5体外抗氧化试验 5
2.2.6林蛙油多糖的纯化 6
2.2.7 林蛙油多糖的结构表征 6
3． 结果与分析 8
3.1林蛙油多糖的判定 8
3.2 林蛙油多糖含量的测定 8
3.3 抗氧化活性的测定 8
3.3.1羟基自由基清除活性 8
3.3.2DPPH清除实验 9
3.3.3还原力实验 10
3.4 林蛙油洗脱曲线分析 11
3.5 林蛙油多糖的单糖组成分析 12
3.5.1红外光谱分析 12
3.5.2单糖组成分析 14
3.5.3分子量分析 15
4．结论 17
5．展望 18
参考文献 19
致谢 21
1．引言
1.1 林蛙油简介
林蛙油主要成分有：蛋白质71%、糖类13.7%、脂类2.6%。林蛙油富含不同种的多糖，多糖是由二十多个乃至上万个单糖组成的一类生物大分子，是由酮糖或醛糖之间通过糖苷键连接在一起而形成的多聚物。它是构成生命的基础物质。多糖具有开关、调谐、作为激素、胞内转运、保护、促进物质吸收、参与血液凝 固、参与细胞识别等多方面的重要生理活性。林蛙输卵管多糖的初步研究结果显示，输卵管组织中可溶性多糖含量极高，占输卵管蛋白质总量的 58.3% ～ 65.7% ,是提取动物多糖良品[3]。
1.2 动物多糖
随着对动物的研究，动物多糖被不断的提取，其是一类具有生物活性的多糖类物质，而且分布极其分布广泛，组织中几乎都有存在。动物多糖主要是存在于动物的细胞中细胞质中，但是又由于多糖的分布不是均一分布的，是根据组织类型进行分布[4]。例如动物多糖中的硫酸软骨素就是分布于骨架中；透明质酸在关节、脐带等地方含量较高，而肝素大多分泌在肝脏等肥大的器官组织中。
1.3多糖常用提取分离方法
多糖的分离方法也是很丰富的。像除蛋白中就有三氯乙酸法、sevage法、三氟三氯乙烷法、酶解法等。色素的去除则通过弱碱性树脂DEAE纤维素来吸附色素[7]，或者常用的吸附剂也可去除。最后将多糖进行纯化，可通过分部沉淀法、柱层析法，本文就采用了凝胶柱层析法来洗脱多糖。
1.4 本实验研究目的及意义
林蛙油是食源性保健食品，也是医疗保健品。林蛙油的研究最早来自于国外，亚洲的久保田精光(1934年），认为其主要成分为蛋白质。国内二十世纪八十年代开始研究林蛙油，自然风干的林蛙油，主要含有粗蛋白、粗脂肪、灰分、氨基酸等成分。之后王春霖、刘奇林等人证实林蛙油中还存在甾类物质、脂肪酸、微量元素等[7]。但对林蛙油的多糖成分研究非常少，林蛙油一些功效是否和其多糖类物质有关，目前尚不明确。因此，研究林蛙油多糖的提取条件、单糖组分以及它们的的结构特征具有重要的意义。
本文以林蛙油为材料，采用超声波胰酶辅助法提取多糖，并进一步采用Sevag脱蛋白；DEAE、葡聚糖凝胶分离单糖组分，应用GC、FTIR等设备分析单糖组分，并对其评价不同单体多糖对羟基自由基、DPPH自由基等的清除能力。
2．材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 原料
林蛙油，吉林长春。
2.1.2 试剂
石油醚
江苏强盛化工有限公司
胰酶
江苏强盛化工有限公司
乙醇
江苏强盛化工有限公司
正丁醇
江苏强盛化工有限公司
三氯甲烷
江苏强盛化工有限公司
浓硫酸
上海强顺化工有限公司
苯酚
上海强顺化工有限公司
浓盐酸
上海强顺化工有限公司
氢氧化钠
江苏强盛化工有限公司
氯化钠
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双氧水
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DPPH试剂
西安沃尔森生物技术有限公司
三氯乙酸（TCA）
天津市致远化学试剂有限公司
铁氰化钾
天津市致远化学试剂有限公司
三氯化铁
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